三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素工艺优化

（河南工业大学粮油食品学院河南省天然色素制备重点实验室，河南郑州450001）

类胡萝卜素是植物和微生物产生的一类重要的天然脂溶性色素，呈黄色、橙色或红色[1]。类胡萝卜素通常分为两类：胡萝卜素类（含碳和氢分子），如β-胡萝卜素和番茄红素；叶黄素类（含碳、氢和氧分子），如叶黄素和玉米黄素[2]。β-胡萝卜素是一种具有高疏水性的萜类分子，具有抗氧化活性和维生素A原的特性，是当前研究最多的类胡萝卜素之一，广泛应用于食品、医药、饲料和化妆品领域[3-6]。

目前，常见的β-胡萝卜素的生产方法有化学合成法、天然植物提取法和微生物发酵法3种。化学合成法往往会导致有害物质残留，在实际应用中受到限制[7]；天然植物提取法由于胡萝卜生产易受到地理、气候、时间和空间的限制，无法大规模生产使用，使得β-胡萝卜素的提取受到影响[8]；微生物发酵生产天然β-胡萝卜素由于不受环境条件的限制，加之产品具有经济、安全等优势，因此该技术受到国内外市场的广泛青睐[9]。

常见的用于发酵法生产β-胡萝卜素的菌种有红酵母、红细菌以及丝状真菌等。其中，三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora，B.trispora）是目前研究最多的 β-胡萝卜素生产菌种，合成机理为利用正负菌种混合培养，产生大量性激素类物质——三孢酸，进而转化合成β-胡萝卜素[10]。三孢布拉氏霉菌发酵法是目前国内外大规模生产天然β-胡萝卜素的最佳方法，它具有生长迅速、生物量大、单位菌体产量高等明显优势。本研究以B.trispora为发酵菌种，通过单因素试验及响应面试验对其发酵工艺进行优化，以期为工业化发酵生产β-胡萝卜素提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 菌种

三孢布拉霉菌cgmcc 3.7815，交配型“+”和三孢布拉霉菌 cgmcc 3.7819，交配型“-”：两菌株（以菌丝保藏）均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖（C6H12O6·H2O，分析纯）、硫酸镁（MgSO4·7H2O，分析纯）、丙酮（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；玉米浆粉（试剂级）：北京索莱宝有限公司；维生素B1（VB1，生化试剂）：天津市光复精细化工研究所；磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯）、氨水（分析纯）：洛阳市化学试剂厂。

1.1.3 培养基

PDA培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。

活化培养基：去皮马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L，115℃灭菌30 min。

种子培养基：黄豆粉（黄豆直接磨粉）50 g/L、玉米粉 25 g/L、0.05 g/L、用盐酸和氨水调pH 6.4～6.7，115℃灭菌30 min。

基础发酵培养基：玉米粉20 g/L、葡萄糖4.8 g/L、黄豆粉 30 g/L、玉米浆粉 2.6 g/L、MgSO40.5 g/L、KH2PO42 g/L，pH自然，115℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

pH计（EL20-K）：美国梅特勒托利多公司；电子分析天平（FA2004N）：上海菁海仪器有限公司；立式高压蒸汽灭菌器（LDZX-75KBS）：上海申安医疗器械厂；生化培养箱（LRH-250）：上海一恒科学仪器有限公司；数显气浴恒温振荡器（SHZ-2A）：金坛华峰仪器有限公司；离心机（TDZ7-WS）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1600B）：上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 B.trispora产β-胡萝卜素发酵工艺优化

菌种活化：取上一代保藏于斜面培养基中的菌种菌丝，划线接种于新的活化培养基中，置于28℃下倒置培养5 d。种子培养：挑取活化培养基上的菌丝接种于装液量为35 mL/250 mL的种子培养基中，28℃、200 r/min条件下培养至对数期。发酵培养：将部分种子液接种于装液量为35 mL/250 mL的基础发酵培养基中，在28℃、200 r/min条件下培养。

在基础发酵培养基的基础上，分别考察负正菌种体积比（0∶0、1 ∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2 ∶1）、发酵时间（96、108、120、132、144 h）、接种量（5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%）、初始 pH 值（6.00、6.25、6.50、6.75、7.00、7.25）、植物油（金龙鱼食用调和油）添加量（0%、1%、2%、3%、4%）、VB1添加量（0.000%、0.001%、0.002%、0.003%）对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响。根据β-胡萝卜素产量筛选影响显著的因子和水平，采用Box-Behnken设计三因素三水平的响应面试验，响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面因素与水平Table 1 Response surface factors and levels

1.3.2 测定方法

β-胡萝卜素产量的测定：参考杨文等[11]的方法，在干菌体中加入5 mL 25%的盐酸，在28℃，200 r/min条件下恒温振荡提取1 h，沉淀物水洗后用10 mL丙酮振荡提取，提取液在456 nm下测定吸光度。

发酵生物量的测定：发酵液在4 000 r/min离心15 min，沉淀物水洗3次后，在105℃的条件下烘干并称重。生物量单位以g/L表示。

1.3.3 数据统计与分析

采用MS Excel 2010进行数据统计；Origin 2018进行单因素方差分析；Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 负正菌接种体积比对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响

不同的负正菌接种体积比可能对β-胡萝卜素产量及发酵生物量产生不同的影响。负正菌种在混合培养的过程中，两菌株互相接触，生成接合孢子，产生三孢酸，能够刺激B.trispora从而促进β-胡萝卜素的大量合成[12-13]。负正菌接种体积比对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响见图1。

图1 负正菌接种体积比对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响Fig.1 Effects of negative and positive inoculation volume ratio on β-carotene yield and fermentation biomass

根据图1可知，当负正菌种体积比为3∶2时，β-胡萝卜素发酵产量最高，达到516 mg/L。接种比例过高过低都不利于B.trispora对β-胡萝卜素的合成。发酵生物量的趋势跟产量比较类似，在接种体积比为3∶2时最大。无论是产量还是生物量，数值最大时负菌数量多于正菌，这说明负菌产色素能力较正菌强[14-15]，但当负菌占比再增加时，产量及生物量都呈下降趋势。

2.1.2 发酵时间对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响

在不同的发酵时间下，菌体的生长情况存在差异。发酵时间对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响见图2。

由图2所示，B.trispora在96 h后开始大量合成β-胡萝卜素，发酵生物量也不断增加，在132 h时，β-胡萝卜素产量及发酵生物量达到最大值。由于培养基中营养成分的消耗，132 h后两者不再增加，在该时间点后产量与生物量都有所下降，这可能是因为菌丝发生自溶。综合考虑菌体生长及产物的合成情况将132 h作为发酵的终点。

图2 发酵时间对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响Fig.2 Effects of fermentation time on yield and fermentation biomass of β-carotene

2.1.3 接种量对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响

接种量对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响见图3。

图3 接种量对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响Fig.3 Effects of inoculation amount on yield and fermentation biomass of β-carotene

由图3所示，随着接种量的不断增加，β-胡萝卜素的产量及发酵生物量也逐渐增加。由此可知，增加接种量有利于产量及生物量的提高，但在接种量超过12.5%后β-胡萝卜素的产量以及生物量都有所下降，可能是因为接种量过大，导致锥形瓶中菌丝生长数量过多，发酵液黏度增大，影响发酵基质的传氧速率，从而造成溶氧量的不足[16]，使得β-胡萝卜素的产量降低。

2.1.4 发酵液初始pH值对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响

发酵液初始pH值对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响见图4。

图4 发酵液初始pH值对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响Fig.4 Effects of initial pH of fermentation broth on yield and fermentation biomass of β-carotene

pH值对于微生物的生长以及产物生成的影响是不可忽视的。pH值的变化会影响菌体内部酶活、细胞结构以及对培养基的利用速率，从而影响菌体的生长以及产物的合成[17]。Choudhari等[18]研究了初始 pH 4～10的培养基对β-胡萝卜素产量的影响，结果表明在pH 6～7之间获得较高的产量。从图4可以得到，本试验采用的B.trispora的最适生长pH值在6.75左右，在该pH值条件下β-胡萝卜素产量以及生物量都比较高，pH值偏大或偏小对菌丝生长及β-胡萝卜素的合成都不利。因此，在发酵过程中应该严格控制发酵液的初始pH值。

2.1.5 植物油添加量对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响

植物油中主要成分为甘油三酯，B.trispora能分泌脂肪酶水解植物油，水解产物可以为β-胡萝卜素的合成提供前体物质——乙酰辅酶A[19]。同时，植物油可以溶解发酵液中脂溶性的β-胡萝卜素，并与水相分离，减少发酵液中产物的抑制作用，从而提高了β-胡萝卜素的产量[20]。本次试验对植物油添加量的影响研究结果见图5。

图5 植物油添加量对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响Fig.5 Effects of vegetable oil on yield and fermentation biomass of β-carotene

由图5根据未添加植物油与添加植物油的β-胡萝卜素产量及发酵生物量的对比发现，添加植物油的影响显著，当植物油添加量达到2%时色素产量达到最大，继续添加植物油后，色素产量及生物量都有逐渐下降的趋势，可能是由于过量的植物油改变了细胞膜的通透性[21]。因此，试验菌种在植物油添加量为2%时对菌丝生长及β-胡萝卜素的合成都比较有利。

2.1.6 VB1添加量对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响

VB1添加量对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响见图6。

图6 VB1的添加量对β-胡萝卜素产量及发酵生物量的影响Fig.6 Effects of on β-carotene yield and fermentation biomass

本试验对VB1添加量的影响进行研究，由图6发现VB1的添加对β-胡萝卜素产量及生物量有一定的影响，当VB1添加量达到0.001%时，色素产量及生物量达到最大，继续添加VB1对其结果影响不大，考虑成本问题可以得出该试验菌种在VB1添加量为0.001%时对发酵生物量及β-胡萝卜素的合成都有利。

2.2 响应面试验优化液态发酵条件

在单因素试验结果上，选择影响最大的3个因素：pH 值（6.50、6.75、7.00）、接种体积比（1 ∶1、3 ∶2、2 ∶1）、植物油添加量（0.00%、2.00%、4.00%），设计三因素三水平响应面试验，将β-胡萝卜素的产量作为响应值。响应面试验方案及结果如表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experiment design and results

续表2 响应面试验设计及结果Continue table 2 Response surface experiment design and results

对表2中的试验数据进行结果分析，得到二次多项回归方程如下：

Y=496.02+7.86A+41.43B+29.80C-6.05AB+4.25AC+7.19BC-201.21A2-97.90B2-8.12C2

此模型可以预测B.trispora液态发酵产β-胡萝卜素的最大产量，以及发酵的最大生物量。其中Y表示β-胡萝卜素产量（mg/L），A、B、C 分别表示pH 值、接种体积比、植物油添加量。

2.2.1 β-胡萝卜素产量结果方差分析

β-胡萝卜素产量结果方差分析见表3。

表3 β-胡萝卜素产量结果方差分析Table 3 Variance analysis of β-carotene yield results

由表3可知，模型的F值是48.66且与其相关的P值小于0.000 1，该结果意味着此模型非常显著。其中决定系数R2=0.984 3，意味着该模型与试验值拟合较好，98.43%的数据都可以由该模型解释[22]。根据上表的数据可以分析得出接种体积比的影响最大，植物油添加量其次，pH值的影响最小。从表中P值可以分析得出B、C、A2、B2对Y值的影响是极显著的，说明试验中各种影响因子对β-胡萝卜素的产量不仅仅只是简单的一元函数关系，其中平方项对产量也有很大的影响，且每个影响因素之间的交互作用对β-胡萝卜素产量也有一定的影响。

pH值、接种体积比和植物油添加量的交互作用对β-胡萝卜素产量的影响见图7。

图7 pH值、接种体积比和植物油添加量的交互作用对β-胡萝卜素产量的影响Fig.7 Interaction of pH，inoculation volume ratio and vegetable oil addition amount on β-carotene yield

根据响应面图7可以看出，接种体积比和植物油添加量的交互作用对产量影响较大，pH值和接种体积比、pH值和植物油添加量的交互作用对产量影响较小，这与回归方程所显示的结果相同。

2.2.2 最优条件的确定与验证

通过响应面软件对方程进行求解，进而得到B.trispora液态发酵产β-胡萝卜素的最佳工艺条件为：pH 6.77、接种体积比1.62∶1、植物油添加量4%，根据上述分析并结合实际试验操作条件，将提取条件改为：pH 6.80、接种体积比1.60∶1、植物油添加量4%，在此条件下β-胡萝卜素的理论产量为523.689 mg/L。根据上述条件进行验证试验，通过3次平行试验得到β-胡萝卜素的产量为523.75 mg/L，较理论值高出0.23%，结果较为理想。因此，响应面法优化液态发酵条件参数很精确，具备实际参考意义。

3 结论

通过单因素试验确定B.trispora产β-胡萝卜素的摇床发酵条件：负正菌种接种体积比3∶2，发酵时间132 h，发酵液初始 pH 6.75，接种量 12.5%，VB1添加量0.001%。对单因素试验进行分析找到影响因素最大的3个因素（pH值、接种体积比、植物油添加量）进行响应面试验，得到了该试验的最佳条件：负正菌接种体积比1.60∶1，发酵液初始pH 6.80，植物油添加量4%，在此条件下B.trispora产β-胡萝卜素产量达到523.8 mg/L，比优化前提高了19.9%。目前来看，三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素的研究仍不够成熟，工业化生产进程缓慢。菌种的退化，发酵过程的调控及代谢机理，未来仍需进一步研究。