新疆地区维吾尔族GABA(A)受体基因多态性与癫痫的关系

高 华,齐会珍,毛洁萍,杨新玲

(1 新疆医科大学第五附属医院神经内科,乌鲁木齐 830011;2 新疆乌鲁木齐市友谊医院神经内科;3 新疆医科大学第二附属医院;*通讯作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

癫痫是脑神经元异常放电产生的一种脑功能失调临床综合征,以药物治疗为主,但仍有约1/3的癫痫患者在治疗后仍有不同类型的发作,成为耐药性癫痫。对于耐药机制的探究已成为癫痫研究热点,其中抗癫痫药物靶分子结构改变是促使药物敏感性降低的原因之一。含有5个亚基的GABA(A)受体作为抗癫痫药物的核心靶点之一,其受体亚基单核苷酸多态性与癫痫易感性及其耐药性的联系也日益受到关注。对癫痫患者的GABA(A)受体亚基基因多态性进行筛查时发现,其中部分单核苷酸基因多态性与癫痫或/和其耐药存在关联性[1,2]。

癫痫与个体遗传、种族特点和地域环境差异有关[3,4],新疆作为以维吾尔族聚集为主的区域,具有其特有的种族特异性和地域特点。基于此特点,本实验开展在维吾尔族癫痫患者人群中GABA(A)受体基因多态性与其癫痫、耐药癫痫的相关性研究,旨在为区域民族癫痫病提供遗传学依据。同时,也有助于早期筛查耐药性癫痫的高危人群,为个体化治疗的方案及远期预后评估提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选择2017-01～2018-08在新疆医科大学附属医院住院或门诊确诊的85例维吾尔族癫痫患者为研究对象。入选标准:①年龄>14岁;②发作至少有2次且间隔至少24 h以上,病史及脑电图(electroencephalogrphy,EEG)检测支持癫痫诊断;③头颅CT或MRI检查排除继发性癫痫。根据2010年国际抗癫痫联盟的耐药性癫痫定义[5],85例癫痫患者包括耐药性癫痫32例,非耐药性癫痫53例。正常对照组90例,均来自同时期体检正常的维吾尔族(无发作记录)。本研究经新疆医科大学第五附属医院学术伦理委员会讨论通过,入选人员均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采集所有入选者静脉血2 ml,DNA提取试剂盒(天根基离心柱型)进行全组DNA的提取,提取过程及步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 引物设计 GABA(A)受体基因rs211037,rs201987位点引物设计由上海生工生物合成。引物序列见表1。依据设计的引物序列,进行进一步的PCR扩增。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3 测序 对GABA(A)受体基因rs211037,rs201987基因位点,选取各样品的PCR产物10 μl进行直接测序(上海生工生物公司完成)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般临床资料的比较

癫痫病例组与对照组在性别、年龄因素均衡性分析后,两组间一般资料对比差异无统计学意义,基线一致(P>0.05,见表2)。

表2 各组一般资料比较Table 2 Comparison of general clinical data between different groups

2.2 遗传平衡检验

癫痫组和对照组人群中GABA(A)受体基因rs211037(χ2=2.751,P>0.05),rs201987(χ2=0.933,P>0.05)位点的遗传平衡状态符合Hardy Weinberg定律。

2.3 GABA(A)受体基因rs211037,rs201987位点PCR扩增及直接测序分析

rs211037,rs201987两个基因位点的扩增产物,目的片段大小分别在566 bp和417 bp处可以获得(见图1)。rs211037,rs201987位点直接测序图:样本表达为CC、CT、TT三种不同基因分型(见图2)。

图1 rs211037,rs201987位点的PCR扩增产物电泳图Figure 1 Electrophoresis of PCR amplification products at rs211037,rs201987

图2 rs211037,rs201987位点基因分型Figure 2 Genotyping of rs211037 and rs201987

2.4 rs211037,rs201987位点的基因型和等位基因频率在病例组和对照组的分布

病例组和正常对照组的两组间的GABA(A)基因rs211037,rs201987位点均存在有CC、CT、TT三种基因类型。病例组中rs211037位点CC基因型频率和C等位基因频率变化与对照组相比,差异均无统计学意义(χ2=0.218,P>0.05;χ2=0.155,P>0.05);其rs201987位点的CC基因型频率和C等位基因频率在病例对照两组间也存在差异无统计学意义(χ2=0.057,P>0.05;χ2=0.161,P>0.05,见表3,4)。

表3 rs211037位点基因型频率、等位基因频率在病例组与对照组的分布 次(%)Table 3 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs211037 site in case group and control group cases(%)

表4 rs211037位点基因型频率、等位基因频率在病例组与对照组的分布 次(%)Table 4 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs201987site in case group and control group cases(%)

2.5 rs211037,rs201987位点的基因型和等位基因频率在癫痫耐药组和非耐药组的分布

在进行癫痫耐药组和非耐药组间的GABAARG2基因rs211037,rs201987位点分析,不论是在CC基因型频率的比较,还是在C等位基因频率的比较,两组间差异均无统计学意义(χ2=0.009,P>0.05;χ2=3.089,P>0.05;χ2=0.339,P>0.05;χ2=0.564,P>0.05,见表5,6)。

表5 癫痫耐药组和非耐药组rs211037位点基因型频率、等位基因频率的分布 次(%)Table 5 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs211037 in in drug resistance group and drug-response group cases(%)

表6 癫痫耐药组和非耐药组rs201987位点基因型频率、等位基因频率的分布 次(%)Table 6 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs201987 in drug resistance group and drug-response group cases(%)

3 讨论

癫痫发生的其中一重要的病理生理机制被认为是脑内兴奋性递质谷氨酸(Glu)和抑制性递质γ-氨基丁酸(GABA)的递质失衡学说,目前认为癫痫的发作与GABA介导的抑制性突触电活动降低有关[6-10]。GABA与GABA(A)受体结合后,可以促使Cl-内流产生抑制性突触后电位,减少或抑制神经元的放电达到细胞稳态化。故GABA(A)受体编码基因改变时,可能导致GABA(A)受体结构变化或敏感性下降,造成癫痫发生,或者在抗癫痫药物使用中,造成药物敏感度下降而产生耐药性癫痫。

目前研究表明,GABA(A)受体的功能状态和癫痫发病有着密切联系。在以往的动物实验中,Richter等[11]体外培养的大鼠脑神经细胞中,可以通过GABA(A)受体上调使神经元电活动减弱。Gasior等[12]也发现在对抗戊四氮(Pentetrazol,PTZ)诱导的大鼠癫痫发作时,可以通过加奈索酮特异性地上调中枢神经系统中GABA(A)受体的表达而完成。与此同时,在对癫痫患者研究中也发现,GABA(A)受体基因的多态性也是造成癫痫产生和耐药癫痫产生的因素之一):Gurba等[13]声称儿童失神癫痫与GABA(A)受体β3亚基的突变G32R有关。Wallace等[5]在一个以热性惊厥和失神癫痫为主要发作形式的家系中发现了GABA(A)受体γ2亚基的突变R43Q。Ding等[14]发现青少年肌阵挛性癫痫中有GABA(A)受体亚基的突变导致其受体表达减少。在关于耐药癫痫研究中,Kim等[15]发现GABRA的rsl2658835和rs35166395位点多态性与耐药癫痫存在相关性。Kumari等[16]也发现GABRA的rs2279020与癫痫易感性和耐药性有关。然而Kinirons等[17]发现在爱尔兰地区人群癫痫患者中rs2279020位点多态性与耐药性癫痫并无相关性,此结论与曹宇泽等[18]在中国汉族癫痫人群的研究结果相同。因此,综合来说对于GABA(A)受体基因多态性的结论也并非一致。本试验研究结果发现,GABA(A)受体基因rs211037,rs201987位点在所有入选病例中都存在有CC、CT、TT三种基因型表达。rs211037,rs201987基因位点不论在癫痫病例组和正常对照组之间,以及癫痫的耐药性和非耐药性分组中,它们的CC基因型频率和C等位基因频率的分布概率,差异均不存在统计学意义(P>0.05),从本次研究结论提示,GABA(A)基因rs211037,rs201987位点多态性在新疆维吾尔族人群和其癫痫病易感性无关联,并且与癫痫耐药性也无关联性。本研究结论中与既往对癫痫汉族人群[18]及爱尔兰癫痫人群[17]研究结论相似,均为阴性。

本试验结果未能提示在新疆地区维吾尔族人群中GABA(A)受体基因多态性与癫痫有关,也未发现与癫痫耐药性相关。分析可能的因素,一方面样本量的大小,另一方面癫痫的不同发作形式,同时癫痫本身遗传学特点可能也是造成目前阴性结果的相关原因。这有待于进一步扩大样本量、以不同种族、地域以及多中心的多基因位点,进行更多的验证,提高结论的一致性。