高效液相色谱法测定新型抗菌肽杆菌七肽的含量

2020-08-11黄邦俊李学莉周晓容

中国饲料 2020年15期

张江，黄邦俊，李学莉，王旭，周晓容

（1.安杰利（重庆）生物科技有限公司，重庆荣昌 402460；2.捷力生科（重庆）生物科技有限公司，重庆荣昌 402460；3.重庆市畜牧科学院，重庆荣昌 402460）

杆菌七肽又名腺苷七肽（Microcin C7肽），是由乳杆菌、肠杆菌属的细菌产生的一类小分子量的细菌素类抗菌肽，其由7个氨基酸残基组成，N端天冬氨酸的羧基与单磷酸腺苷（AMP）通过N-酰基氨基磷酸酯键共价连接组成的核酸肽。不同微生物分泌的杆菌七肽其氨基酸序列有所差别，但其第一个氨基酸蛋氨酸和第七个氨基酸天冬氨酸为其保守序列（Olga 等，2014；Severinov，2012）。杆菌七肽主要抑菌机理为干扰微生物翻译蛋白来实现抑菌作用（冉仁森，2017；Metlitskaya等,2006）。杆菌七肽对革兰氏阴性菌大肠杆菌、沙门氏菌以及某些革兰氏阳性菌均具有很强的杀灭和抑制作用，是潜在的抗生素替代品（冉仁森，2017）。杆菌七肽可采用化学合成法和微生物发酵法生产。而建立杆菌七肽定量检测方法对于其生产和品控具有重要意义，可以使相关企业进行质量控制，监测产品在生产和使用过程中的稳定性。许多研究表明，细菌素类抗菌肽如NISIN可以采用反向高效液相色谱法测定，具有快速、简单和重复率高的优点（高彩红等，2011），鉴于杆菌七肽含量的测定鲜有报道，本研究目的就是建立一种应用高效液相色谱（HPLC）来快速定量测定杆菌七肽的方法。

1 材料和方法

1.1 实验材料样品：杆菌七肽纯品（纯度99.5%），制备方法参考 Yu等（2017）方法，由国家饲料工程技术研究中心西南分中心提供；杆菌七肽喷雾干燥粉，由安杰利（重庆）生物科技有限公司提供，载体为可溶性淀粉，工艺为约氏乳杆菌发酵、离心、浓缩加入麦芽糊精后进行喷雾干燥获得。

仪器：高效液相色谱仪（赛默飞Ulti-Mate3000）、C18（4.6 mm×150 mm）反相色谱柱、电子天平（BT2202S）、超纯水仪（Milli-Q）、台式离心机、溶剂过滤器、漩涡混合器（VORTEX 2）、0.22 μm水相滤膜和有机相滤膜、离心管（2、10 mL）、试管等。

试剂：三氟乙酸TFA（色谱级）、乙腈（色谱级）、超纯水（Milli-Q）。流动相A（0.1%TFA ）的配制：量取 1000 mL超纯水，加入 1 mL TFA，用 0.22 μm滤膜过滤，超声脱气10 min；流动相B（80%乙腈）：量取 800 mL乙腈，加超纯水200 mL，用 0.22 μm有机滤膜过滤，超声脱气10 min。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品（标准品）制备称取450 mg杆菌七肽纯品，定容于100 mL，超声波振荡15 min，使其全部溶解，则抗菌肽浓度为4.5 mg/mL。

1.2.2 样品前处理准确称量1.00 g样品于25 mL容量瓶中，加入纯水，用超声处理15 min后定容至25 mL，再次颠倒混匀后取出6 mL于三个2 mL离心管内，8000 r/min离心2 min后用0.22 μm滤膜过滤，将前约1 mL溶液弃去，后面的溶液接样检测。

1.2.3 高效液相的检测依次开启电脑和高效液相色谱仪各模块电源，然后打开高效液相色谱仪化学工作站。逆时针旋开液相色谱仪放空阀打开旁路，用0.22 μm过滤的超纯水冲洗管路，流速为5 mL/min时，再用流动相A、B充满管路。接上连接有保护柱的反相色谱柱，参数设为：柱温：25℃（室温），检测波长：280 nm（214 nm 为参考波长），最大压力：300 bar，流速：1 mL/min，样品分析洗脱梯度如表1所示。系统平衡至基线水平，检测系统适应性：取抗菌肽标准品适量，加水溶解并稀释成1 mL含抗菌肽0.5 mg的溶液，作为系统适用性溶液，进样量10 μL，连续进样3次测定，峰面积RSD≤2%，表明系统能满足检测要求。

表1 样品洗脱梯度

1.2.4 标准曲线的绘制将抗菌肽溶液（浓度为4.500 mg/mL）按照2倍稀释，分别得到2.250、1.125、0.563、0.281 mg/mL的溶液，以双蒸水为对照，每个浓度检测3次，通过液相获得峰面积（峰面积单位用mAU*min表示）。

1.2.5 加标回收率实验对照品和不影响其检测的可溶性载体（元明粉），制成2%、1%和0.50%杆菌七肽含量的样品，进行3次检测，计算回收率。

1.2.6 稳定性实验将供试品溶液至于室温条件下，分别于 0、4、8、16、24 h 取 10 μL 注入液相色谱仪，测定峰面积，记录抗菌肽峰面积值，计算相对标准偏差（RSD）。

1.2.7 精密度实验精密吸取对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，于同日内重复测定 6次，计算日内精密度;连续测定 5 d，计算日内相对标准偏差（RSD）。

1.3 统计分析数据采用Excel进行计算平均值、标准偏差、相对标准偏差和回归曲线。

2 结果与分析

2.1 专属性实验在1.2.3的色谱条件下，杆菌七肽对照品（标准品）的保留时间为13.9 min（图1），其杆菌七肽样品（喷雾干燥粉末）在保留时间13.9 min处有明显的峰（图2），杆菌七肽与相邻的峰分离度为2.2（大于1.5），而阴性对照（水）对应保留时间无峰面积。

2.2 回归曲线的绘制以高效液相色谱获得的峰面积为纵坐标（Y），上样浓度（mg/mL）为横坐标（X），得出回归曲线为 Y=10.353X+0.3806，R2=0.9997（n=6），抗菌肽浓度为 0 ～ 4.5 mg/mL 时与峰面积的线性关系良好（图3）。每个浓度梯度上样三次，RSD均小于2%（表2）。

表2 杆菌七肽浓度和相应的峰面积

2.3 加标回收率实验表3结果显示，抗菌肽含量为0.25%～2.00%时，其回收率为96.0%～108.0%，表明其回收率较好，误差较小。

表3 回收率实验

2.4 稳定性实验由表4可知，经过0、4、8、16、24 h测定杆菌七肽的含量，峰面积和含量RSD均小于2%，表明其在24 h内稳定性较好。

表4 稳定性实验结果

3 讨论

采用反向高效液相色谱法可快速测定杆菌七肽的含量，其方法简单、重复性较好，徐和等（2013）采用C18色谱柱，流动相为甲醇-乙腈-0.05%TFA溶液，建立了高效液相色谱法测定小菜蛾中抗菌肽CA抗菌肽含量的方法；高彩红等（2011）采用采用C18色谱柱，流动相为10%乙腈-90%乙腈，建立了高效液相色谱法测定乳链球菌素含量（效价）的方法；这些方法简单、准确性高。借鉴之前已发表的研究结果，本研究采用C18色谱柱，以80%乙腈 -0.1%TFA为流动相，测定杆菌七肽的含量，实验结果发现其分离度较好，不受杂峰的影响，可以清晰的辨别目的峰，说明此色谱条件是合适的。本实验通过绘制标准曲线，杆菌七肽浓度为0～4.5 mg/mL时线性关系较好（R2=0.9997），RSD＜2%。通过加标回收率实验，其回收率为96%～108%，验证了标准曲线是正确的，可以用作杆菌七肽含量检测。通过稳定性实验，发现室温下杆菌七肽在24 h内稳定性较好。杆菌七肽高效液相测定方法的建立，对于生产过程中的质量控制（QC）和质量保证（QA）提供了科研依据，同时，为进一步研究杆菌七肽在体内动力学的测定提供了参考方法。