大豆异黄酮对高温下体外培养奶牛乳腺上皮细胞增殖和抗氧化能力的影响

姜淑妍

（长春职业技术学院，吉林长春 130504）

大豆异黄酮是从大豆中提取的次生代谢产物，表现弱雌激素样作用，具有抗氧化、抗肿瘤等生理功能（徐春华等，2010）。郝振荣等（2010）研究发现，在奶牛的日粮中添加大豆异黄酮能够增强奶牛的免疫功能，提高奶牛泌乳性能。方洛云等（2015）也研究发现，大豆异黄酮能够提高奶牛体内的抗氧化酶活性，改善奶牛的产奶性能。以上结果说明，大豆异黄酮能够作为一种添加剂在奶牛上应用。乳腺上皮细胞是合成和分泌乳汁的主要场所，奶牛对高温较敏感，当环境温度过高时，就会激活Caspase-3活性，诱导乳腺上皮细胞凋亡，从而降低产奶量和乳品质（张响英等，2017）。研究发现，培养基中添加10、100、1000 mg/L大豆异黄酮能够提高奶牛乳腺上皮细胞的增殖和泌乳性能，增强细胞的抗氧化能力（穆莹和江连洲，2013；卢志勇等，2013）。目前，研究大豆异黄酮对高温下体外培养奶牛乳腺上皮细胞的影响还鲜见报道。权素玉等（2016）研究发现，奶牛乳腺上皮细胞在42℃高温下1.5 h内细胞活率持续降低，2 h后开始恢复。说明高温处理2 h后细胞逐渐适应高温环境，存活率短期内不再下降。因此，本试验拟在42℃高温处理1.5 h下，研究大豆异黄酮对奶牛乳腺上皮增殖和抗氧化的影响，目的是了解大豆异黄酮能否缓解高温对奶牛乳腺上皮细胞的损伤。

1 材料与方法

1.1 试验材料 奶牛选用吉林九台广源牧业有限公司荷斯坦奶牛；纯度为98%的大豆异黄酮购于大连绿峰食品有限公司。奶牛乳腺上皮细胞采用组织块法培养。无菌条件下剪取健康荷斯坦奶牛的乳腺组织，清除脂肪，剪成小块（1 mm3）接种培养，然后参照狄和双等（2006）方法进行细胞的分离、培养和纯化。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞活性 将1×104个奶牛乳腺上皮细胞接种于96孔板中，分为4组，每组基础培养基中分别加 0、10、100 μg/mL 和 1000 μg/mL 大豆异黄酮，每组8个重复。大豆异黄酮溶于二甲基亚砜（DMSO），其中DMSO含量为1.5‰。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，再在42℃、5%CO2培养箱中培养 1.5 h，然后在 37℃、5%CO2培养箱中培养12 h后去除培养液，分别每孔加入培养基100 μL和10 μL CCK-8溶液，在培养箱中孵育3 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光值，然后根据试剂盒说明书上的公式计算细胞相对活性。

1.2.2 抗氧化指标的测定 将1×105个/mL的奶牛乳腺上皮细胞接种到12孔板，试验分组同上，每组4个重复。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，再在42℃、5%CO2培养箱中培养1.5 h，然后在37℃、5%CO2培养箱中培养12 h后收集细胞，然后使用南京建成试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性和一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量。操作步骤和检测方法按照试剂盒的说明书进行。

1.2.3 活性氧（ROS）的检测 将 1×105个/mL的奶牛乳腺上皮细胞接种到12孔板，试验分组同上，每组4个重复。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，再在42℃、5%CO2培养箱中培养1.5 h，然后在37℃、5%CO2培养箱中培养12 h后收集细胞，细胞按照南京建成试剂盒上的方法进行处理后用流式细胞仪进行检测。

1.2.4 基因表达的测定 将5×105个/mL的奶牛乳腺上皮细胞接种到6孔板，试验分组同上，每组4个重复。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，再在42℃、5%CO2培养箱中培养1.5 h，然后在37℃、5%CO2培养箱中培养12 h后去除培养基，根据Qiagen试剂盒中的说明书进行提取RNA，检测浓度和纯度后反转录成cDNA。按照Takara荧光定量PCR试剂盒说明书上步骤进行操作，然后在Bio-Rad PCR仪上进行基因表达的检测。被检测的基因引物根据Gene Bank中序列进行设计，并由上海生工公司合成。引物设计见表1。

表1 引物设计

1.3 数据分析 先将数据用Excle 2010进行预处理，结果用“平均值±标准差”表示，然后用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析 （ANOVA），采用LSD法进行多重比较，以P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 大豆异黄酮对奶牛乳腺上皮细胞活性的影响 由表2可知，与0 μg/mL组相比，高温培养下添加100 μg/mL和1000 μg/mL大豆异黄酮能够显著提高奶牛乳腺上皮细胞活性（P＜0.05），其中1000 μg/mL组细胞活性最高。结果表明，大豆异黄酮能够促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖。

表2 大豆异黄酮对奶牛乳腺上皮细胞活性的影响

2.2 大豆异黄酮对细胞活性氧水平的影响 由表3可知，与0 μg/mL组相比，高温培养下添加10～1000 μg/mL大豆异黄酮能够显著降低奶牛乳腺上皮细胞活性氧的浓度（P＜0.05），且活性氧浓度随着大豆异黄酮添加水平的升高而显著下降（P＜0.05）。结果表明，大豆异黄酮能够抑制奶牛乳腺上皮细胞活性氧的产生。

表3 大豆异黄酮对奶牛乳腺上皮细胞活性氧水平的影响

2.3 大豆异黄酮对细胞抗氧化能力的影响 由表 4 可知，高温培养下，100 μg/mL 和 1000 μg/mL大豆异黄酮组奶牛乳腺上皮细胞的GSH-Px活性显著高于 0 μg/mL 和 10 μg/mL 组 （P ＜ 0.05），而NO浓度则相反。细胞的CAT活性随着培养基中大豆异黄酮添加水平的升高而显著升高 （P＜0.05），LDH活性随大豆异黄酮添加水平的升高而显著降低 （P＜0.05）。 与0 μg/mL组相比， 添加10～1000 μg/mL大豆异黄酮组细胞的SOD活性显著升高（P＜0.05），MDA的浓度显著降低（P ＜0.05）。结果表明，大豆异黄酮能够提高奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力。

表4 大豆异黄酮对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化能力的影响

2.4 大豆异黄酮对细胞凋亡基因的影响 由表5可知，与0 μg/mL组相比，高温培养下添加100 μg/mL和1000 μg/mL大豆异黄酮能够显著降低奶牛乳腺上皮细胞内Caspase3和Bax基因的相对表达（P＜0.05），但能够显著升高细胞内Bcl-2基因的相对表达（P＜0.05）。结果表明，大豆异黄酮能够抑制奶牛乳腺上皮细胞的凋亡。

表5 大豆异黄酮对奶牛乳腺上皮细胞凋亡基因的影响

3 讨论

大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类生物活性物质，其结构形式是3-苯并吡喃酮为母核的化合物，属于黄酮类化合物。研究发现，黄酮类物质如大豆黄酮和槲皮素均能够提高奶牛乳腺上皮细胞的活性（陈静，2012；刘春龙等，2008）。 说明黄酮类物质有促进细胞增殖的作用。42℃高温处理下，引起氧化应激，导致奶牛乳腺上皮细胞生长受阻，成活率降低，细胞凋亡率升高（权素玉等，2016；周振峰等，2010）。说明热应激能够促进奶牛乳腺上皮细胞的凋亡。有人认为，热应激能够升高心肌细胞活性氧浓度，进而导致细胞凋亡 （宋学立等，2000）。机体在高温下会导致体内氧化还原系统失衡，抗氧化酶类活性下降，促使体内活性氧升高，从而造成氧化应激（苗启翔等，2019）。本试验中，在高温下，奶牛乳腺上皮细胞中的活性氧浓度随着大豆异黄酮添加水平的提高显著降低，而细胞的相对活性显著升高；添加100～1000 μg/mL的大豆异黄酮能够提高细胞的谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的活性，降低乳酸脱氢酶活性以及一氧化氮和丙二醛含量。结果说明，大豆异黄酮能够通过提高细胞的抗氧化酶类的活性，降低细胞活性氧浓度，进而抑制高温对奶牛乳腺上皮细胞的氧化损伤，促进细胞的增殖。

Caspase家族中的Caspases3是细胞程序性死亡的介导者和执行者，在正常情况下，其以无活性的酶原形式存在于胞浆中，当被激活时，会引起细胞凋亡（赵瑞杰等，2010）。在高温刺激下会导致细胞内活性氧升高，当活性氧积累到一定水平就会导致Bax表达和Caspase活化；而Bcl-2能够影响细胞内质网内钙离子的释放，抑制自由基的产生以及与Bax结合来抑制细胞凋亡 （王彤等，2008）。在本试验中，高温刺激下，添加100～1000 μg/mL大豆异黄酮能够降低Caspases-3和Bax的表达，升高Bcl-2的表达。结果说明，大豆异黄酮能够缓解高温促奶牛乳腺上皮细胞凋亡的作用。

4 结论

培养基中添加100～1000 μg/mL大豆异黄酮能够通过提高细胞的抗氧化能力，降低细胞内活性氧水平，下调Caspases3和Bax的表达，上调Bcl-2的表达，进而抑制奶牛乳腺上皮细胞的凋亡，促进细胞增殖。