α-卡茄碱对仔猪小肠上皮细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响

2020-08-11何玉华潘俊林赵鑫玉于继宝李轩宇

中国饲料 2020年15期

何玉华，潘俊林，赵鑫玉，于继宝，李轩宇

（吉林农业科技学院动物科技学院，吉林左家 132109）

α-卡茄碱是马铃薯糖苷生物碱的主要组成成分，占其总量的95%左右。马铃薯的副产品未得到很好的开发和利用，马铃薯中的糖苷生物碱是影响其利用的主要因素之一。关于α-卡茄碱毒性方面的报道较多，但也有研究表明α-卡茄碱具有生物活性，能够抑制某些炎症的发生，对真菌、霉菌、大肠杆菌、白菜白斑菌和葱紫斑菌等有很好的抑菌效果，还可以通过促进癌细胞的凋亡而起到抗癌的作用，对血管还有保健作用，能够预防高血压的形成（钟淇滨，2018；郭翔，2014；张磊等，2014）。随着马铃薯渣、茎叶等副产品的开发利用，关于α-卡茄碱的研究也将成为进一步的研究热点，本试验将α-卡茄碱作用于仔猪小肠上皮细胞，探讨其对仔猪小肠上皮细胞生长情况及生长状态的影响，为其在猪、牛、羊等动物饲料中的应用提供基础研究（曹军丽，2018）。

1 材料与方法

1.1 试验材料 α-卡茄碱（成都植标化纯生物技术有限公司），仔猪小肠上皮细胞系（深圳市豪地华拓生物科技有限公司）。

0.25 %胰酶（雷布斯，SH30042.01）（王帅伟，2016），4%的多聚甲醛固定液（郑州佰沃生物质材料有限公司，wabcan-062701），聚乙二醇辛基苯基醚（南通丰源化工有限公司）（韩洋洋，2018），抗荧光淬灭封片剂（Phygene，25 mL），DAPI（Phygene，PH0524）（田青等，2013）。

1.2 试验设计用α-卡茄碱对培养的仔猪小肠上皮细胞进行刺激，α-卡茄碱的添加水平分别为0 μg/mL （A 组）、0.4 μg/mL （B 组）、0.8 μg/mL（C组），每一个处理分别设 3个重复，在细胞培养24、48、72 h的时候，收取细胞样品，然后对仔猪小肠上皮细胞生长情况及生长状态进行测定（靳换，2017；何玉华，2017）。

1.3 细胞培养经复苏后的仔猪小肠上皮细胞培养（何玉华，2017；赵宝等，2017；郭楠，2015）。

1.4 细胞增殖率的测定本试验采用体外细胞培养法，在仔猪小肠上皮细胞中加入α-卡茄碱之后的24、48、72 h采集细胞样品，测定细胞的MTT值。

在对数生长期的时候，收集长势不错的仔猪小肠上皮细胞，然后使用1640培养基，之后对细胞密度进行调整，使其达到5×104个/mL，然后接入96孔的细胞培养板进行培养（何玉华，2017；陈伟，2016；李慧冰，2012；王宇，2005）。在细胞培养24、48、72 h 后，每个孔中加入 10 μL 的 MTT，在37℃的条件下培养4 h（李好磊，2017）。吸出培养基之后，再加入150 μL的DMSO，进行振荡大约10 min（卢杜丹，2016）。使用酶标仪来测定各孔的吸光值OD568。

1.5 流式细胞仪分析细胞周期

1.5.1 细胞的传代在细胞密度达到80%的时候，将细胞进行传代：（1）去掉原来的培养基之后用PBS进行清洗；（2）加入1～2 mL 0.25%的胰蛋白酶进行细胞的消化，在显微镜下进行观察，消化1～2 min，便可以看到细胞变圆、随即相互分离，则完成消化（武跃华，2010）；（3）参照张君（2017）、卢晓清（2017）的方法进行扩繁。

1.5.2 细胞冻存细胞冻存步骤为：（1）在长势较好的细胞中加入1～2 mL 0.25%的胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察，消化1～2 min，可以看到细胞变圆、随即相互分离，则完成消化（王冠楠，2018；郑丽萍，2017）；（2）快速弃去胰酶，加入完全培养基，吹打细胞，制成单细胞悬液，1200 r/min，离心 5 min，去上清（钱保江，2014）；(3）加完细胞冻存液之后，把冻存管转移到梯度冻存盒里，在-70℃条件下放置过夜后，把冻存管转到液氮里可以长时间的贮存（何玉华，2017）。

1.5.3 细胞周期检测细胞周期检测步骤为：（1）在对数生长期，将长势不错的仔猪小肠上皮细胞，用1640培养基调整，当细胞的密度到1.5×105个/mL的时候接入6孔板，每孔中2 mL的细胞悬液，于 37 ℃培养过夜（何玉华，2017）；（2）在细胞培养结束之后，用0.25%的不含EDTA的胰酶消化细胞，在消化完成之后收集细胞，1200 r/min，离心5 min，去掉上清液，PBS重悬并润洗2次（刘璐，2014）；（3）逐渐加入预冷的80%乙醇700 μL，当乙醇达到 70%的浓度时结束；（4）4 ℃条件下进行固定，要达到 4 h 以上；（5）1200 r/min，离心5 min，预冷PBS润洗2次；（6）然后加100 μL RNase（50 μg/mL），37 ℃条件下进行孵育，时间为30 min；（7）再加 400 μL 的 PI（50 μg/mL），4 ℃及避光条件下进行染色，时间为30 min；（8）分别于24、48、72 h的时候用流式细胞仪进行检测。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 α-卡茄碱处理24、48、72 h后在流式细胞仪上进行检测（王婷，2015），具体按照细胞凋亡检测试剂盒中的说明书进行。

2 结果与分析

2.1 α-卡茄碱对仔猪小肠上皮细胞增殖率的影响从表1可知，α-卡茄碱作用于仔猪小肠上皮细胞24、48、72 h后，B组、C组细胞增殖率与A组相比有所降低，且差异显著（P＜0.05），分别降低3.67%、14.78%，8.63%、20.81%，19.39%、28.18%。

表1 α-卡茄碱对仔猪小肠上皮细胞增殖率的影响

2.2 α-卡茄碱对仔猪小肠上皮细胞周期的影响从表 2 可知， G0/G1期，24、48、72 h 时，随着 α-卡茄碱添加水平的增加而逐渐增加，B组、C组和A组相比，分别增加 19.84%、38.30%，19.17%、52.39%，32.17%、56.14%，差异显著（P＜ 0.05）。S期逐渐降低，B组、C组和A组相比差异显著（P＜0.05），24 h 降低 10.61% 、29.84% ；48 h 降低14.95%、32.51%；72 h降低 25.13%、40.27%。G2/M期逐渐下降，B组、C组和A组相比24 h时分别下降 8.66%、12.44%，差异不显著（P ＞ 0.05）；48 h分别下降 15.73%、69.13%，差异显著（P ＜ 0.05）；72 h时分别下降34.40%、86.27%，差异显著（P＜0.05）。

2.3 α-卡茄碱对仔猪小肠上皮细胞凋亡的影响从表3可知，细胞的凋亡率随着α-卡茄碱浓度和作用时间的增加而增加。α-卡茄碱作用细胞24、48、72 h后，B组、C组和A组相比差异显著（P＜0.05），分别增加220.50%、505.50%，121.93%、218.31%，69.12%、382.54%。

表2 α-卡茄碱对仔猪小肠上皮细胞周期的影响

表3 α-卡茄碱对仔猪小肠上皮细胞凋亡的影响

3 讨论

为了更好地适应环境或者减少外界环境的干扰，细胞存在主动凋亡的现象，与酶的调节、基因的表达有关。激素、抗营养因子、毒素等都会抑制细胞的增殖，导致细胞凋亡。

中草药龙葵被很多的研究者发现并研究，从中提取澳洲茄碱，并作用于肺癌细胞，发现其有抑制癌细胞增殖的作用，主要是通过诱导细胞凋亡和坏死来实现的。本试验中α-卡茄碱也抑制了细胞的增殖，α-卡茄碱作用于仔猪小肠上皮细胞24、48、72 h 后，0.4、0.8 μg/mL 组细胞增殖率与 0 μg/mL 组相比有所降低，且差异显著（P＜0.05）。

陈来等（2014）通过多年的试验得出澳洲茄碱对黑色素瘤B16癌细胞的抑制作用，通过多种途径激活p53通路，这可能是造成黑色素瘤细胞死亡的根本途径。龙葵碱可以使HepG2细胞阻滞在S期，抑制DNA的合成，并诱导其凋亡（任明媛，2017）。龙葵碱对前列腺癌细胞系PC-3也具有抑制作用，并诱导其凋亡（章俊等，2011），本试验也得到了相似的结果，本试验的结果表明，G0/G1期，24、48、72 h时，随着α-卡茄碱添加水平的增加而逐渐增加，0.4、0.8 μg/mL 组和 0 μg/mL 组相比差异显著（P ＜ 0.05）。 S 期逐渐降低，24、、48、72 h时，0.4、0.8 μg/mL 组和 0 μg/mL 组相比差异显著（P ＜ 0.05）。G2/M 期逐渐下降，24 h 时 0.4、0.8 μg/mL组和 0 μg/mL 组相比差不异显著（P ＞ 0.05）；48、72 h 时 0.4、0.8 μg/mL 组和 0 μg/mL 组相比差异显著（P ＜ 0.05）。

糖苷生物碱（α-卡茄碱和α-茄碱）主要存在于彩色马铃薯，其功能很多，有抗癌作用，对癌细胞有抑制作用。α-卡茄碱可以使细胞膜的结构发生改变，破坏细胞膜的离子通道。α-卡茄碱促进细胞凋亡的途径有以下几种：一是促进人体肝癌细胞活性氧自由基的生成而使癌细胞凋亡；二是通过提高HepG2细胞中凋亡相关蛋白（ASK1和TBP-2）的表达，进而激活下游信号激酶如JNK和p38，同时抑制HepG2细胞促增殖蛋白HDAC1而促进细胞凋亡；三是和其他成分的协同作用。马铃薯中的α-卡茄碱对很多肿瘤细胞具有明显的抑制作用，但需要和其他多种活性成分联合作用。