菊芋全粉与地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长性能、免疫能力及肠道菌群变化的影响

孟现尧 ， 朱晓振 ， 贾晨晨 ， 衣悦涛

（1.中国科学院烟台海岸带研究所，山东烟台 264003；2.中国科学院大学，北京 100049；3.中国科学院海洋大科学研究中心，山东青岛266071）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是世界最主要的养殖对虾品种，也是我国最大的水产品出口品种；同时对虾养殖业也是我国水产养殖业的支柱性产业（陈学洲等，2016）。目前，我国凡纳滨对虾的年产量约为150万吨。但是由于凡纳滨对虾缺乏特异性免疫，在大规模高密度养殖模式下极易感染虾病，死亡率极高，2017年全国平均养殖成功率仅有20% ～30%（陈建等，2018）。这严重制约了对虾养殖业的健康发展。

当使用抗生素不能有效控制疫情，并且造成了严重的环境污染，进而加速耐药菌株产生的问题后（谢达尧，2018；陈燕军，2007）。为了改善对虾的抗病性，减少抗生素的使用，利用益生元、益生菌完善对虾肠道健康成为一种效果良好的新方法。研究表明，益生菌可以改善水体，促进水产动物生长，抑制致病菌，强化宿主先天免疫（Farzanfar等，2010）；而益生元可以通过促进益生菌的增殖来提高饲料转化率，改善黏膜屏障修复细胞损伤，调节肠道菌群平衡，提高抗病力 （Ringo/等，2010）。地衣芽孢杆菌因为可以提供营养物质，并且具有促进生长，调节肠道微生物平衡，增强机体免疫力，改善水质等作用，而广泛应用为饲料添加剂（袁慧坤等，2019）。菊粉是一种水溶性益生元，具有调节肠道微生态平衡，提高宿主非特异性免疫等功能。菊芋全粉成本更低，微溶于水，含有50%以上的菊粉。所以本试验选择菊芋全粉和地衣芽孢杆菌为饲料添加剂应用于对虾养殖中，研究其对凡纳滨对虾生长性能、免疫应答以及肠道菌群变化的影响。以期为菊芋全粉和地衣芽孢杆菌在对虾健康养殖上的联合应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物 试验所用凡纳滨对虾来自山东东方海洋科技股份有限公司，初始平均体重为（0.9±0.1）g。在中国科学院牟平海岸带环境综合试验站，使用 200 L塑料水箱饲养，水温（28±1）℃，pH 8.1，盐度 30‰。 每天投喂 4 次（7：30、11：00、17：00、21：00），投喂量为对虾体重的 5%，若没有食物残渣剩余，则第二日饲料投喂量增加20%。每日及时清除粪便与食物残渣，换水80%，暂养一周后用于试验。

1.2 试验设计 暂养结束后，挑选1200尾健康对虾，随机分为4组，每组3个平行，每个平行100尾对虾。对照A组喂食基础饲料，试验B、C、D组分别在基础饲料中添加1%菊芋全粉、108cfu/g地衣芽孢杆菌和1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢杆菌，饲养周期为4周。基础饲料为烟台远景生物技术有限公司的对虾饲料原料，按配比混匀后加水揉匀，挤压造粒，自然晾干。营养水平如表1所示。

表1 基础饲料营养成分%

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能测定 试验前记录平均初重W0，初始尾数N0。饲养四周后，各组对虾禁食24 h，记录最终平均体重 Wt，最终尾数 Nt。 成活率（SR）、特殊生长率（SGR）、饲料转化率（FCR）计算公式如下：

式中：T为饲养试验天数，d；F为对虾的摄食总量，g。

1.3.2 血细胞计数及呼吸爆发测定

1.3.2.1 血细胞计数 （THC） 试验结束后，取3只对虾血淋巴与抗凝剂 （0.02 moL EGTA，0.48 moL NaCl，0.019 moL KCl和.068 moL Tris-HCl，pH 7.6）1：1混合制成细胞悬液，在光学显微镜下通过血球计数板计数。

1.3.2.2 呼吸爆发 （RB） 将细胞悬液按照Hong等（2006）的适当调整后测量巨噬细胞呼吸爆发。

1.3.3 血淋巴免疫因子活性测定 将对虾在冰盘上用1 mL针筒在头胸甲处取血淋巴，在4℃、3000 r/min下离心10 min，取上清-80℃保存，用作血淋巴免疫指标的测定。对虾血淋巴的总抗氧化能力（T-AOC）和溶菌酶（LZM）使用南京建成公司试剂盒测定。

1.3.4 肠道微生物分析 在冰盘上取出虾线，无菌水清洗，-20℃保存，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序和生物信息学分析。根据16S rRNA基因V3～V4区序列设计如下引物：正向引物338F 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；806R 5’ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。原始数据滤掉低质量序列后得到有效数据，进行OTUs（Operational Taxonomic Units） 聚类，分析微生物α多样性（Chao指数、Shannon指数及Simpson指数）、β多样性和微生物群落组成、丰富度，发掘不同试验组之间的差异。

1.4 数据处理与分析 数据用 SPSS 18软件进行单素方差分析（One-way ANOVA），结果以“平均值±标准差”表示，当P＜0.05时为差异显著。

2 结果与分析

2.1 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长性能的影响 由表2可知，与基础饲料对照A组相比，所有试验组的最终体重和特殊生长率都没有显著性差异（P＞0.05）。另外，108cfu/g地衣芽孢杆菌试验C组存活率显著高于对照A组 （P＜0.05）；1%菊芋全粉试验B组和108cfu/g地衣芽孢杆菌试验C组同对照A组相比，饲料利用率显著提高（P＜0.05）。

表2 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长性能的影响

2.2 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾免疫能力的影响

2.2.1 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾THC的影响 由图1可知，与对照A组（0.35×106/mL）相比，1%菊芋全粉试验 B 组（0.44×106/mL）与 108cfu/g地衣芽孢杆菌试验C组（0.86×106/mL）血细胞数目没有显著性差异 （P＞0.05），1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢杆菌试验D组（1.17×106/mL）具有显著性差异（P ＜ 0.05）。

2.2.2 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾RB的影响 如图2所示，108cfu/g地衣芽孢杆菌试验C组与1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢杆菌试验D组RB相对值（1.43、1.90）较对照A组显著提高（P＜0.05），但试验C、D组之间没有显著性差异（P ＞ 0.05）。

2.2.3 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾血淋巴免疫因子应答的影响 由图3可知，与基础饲料对照A组（0.24 U/mL）相比，所有试验组T-AOC活性 （0.38、0.32、0.39 U/mL） 都显著提高 （P ＜0.05），且不同试验组之间没有显著性差异，其中以1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢杆菌试验D组T-AOC活性最高。如图4所示，与基础饲料对照A组（70.69 U/mL）相比，所有试验组LZM活性（108.82、145.81、135.24 U/mL）都显著提高 （P ＜0.05），以108cfu/g地衣芽孢杆菌试验C组LZM活性最高，不同试验组之间没有显著性差异。

2.3 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物的影响

2.3.1 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物α多样性的影响 经过四周的养殖试验，分析各试验组对虾的肠道菌群变化。试验组平均有（51937±2953）个高质量的序列，这些序列可以聚类成1126个特殊的操作分类学单位（OTUs，序列标识97%）。图5～7显示，添加菊芋全粉与地衣芽孢杆菌后，凡纳滨对虾肠道菌群丰富度（Chao指数）、多样性（Shannon 指数）、均匀度（Simponeven指数）均无显著性变化（P＞0.05）。但是108cfu/g地衣芽孢杆菌试验C组和1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢杆菌试验D组肠道菌群丰富度具有不同程度的提高，菊芋全粉与地衣芽孢杆菌表现出了一定的协同作用；1%菊芋全粉试验B组和1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢杆菌试验D组肠道菌群多样性也有不同程度提高。

2.3.2 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物β多样性的影响 基于Bray-Curtisdistance算法的主坐标分析（PCoA）表明，试验对虾肠道菌群结构按照处理状况聚类，其中第一轴和第二轴共同解释了73.53%的肠道微生物群落差异 （图8）。试验组与对照A组之间的分散程度存在显著性差异，菊芋全粉与芽孢杆菌可以改变凡纳滨对虾肠道微生物的菌落聚集情况。非度量多维尺度分析（NMDS）也得出了相似的结论（图9）。

2.3.3 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物种类的影响 通过物种注释分析，评估各试验组对虾肠道微生物种类的相对丰度，对其进行比较分析，在门的水平上发现了4个主要菌群（图10～11）。根据丰度的排名依次为变形菌门（74.28% ～ 88.08%，α-变形菌纲、γ-变形菌纲）、拟杆菌门（7.69%～21.57%，拟杆菌纲）、放线菌门（1.08% ～3.60%，放线菌纲）、厚壁菌门（0.06% ～3.11%，芽孢杆菌纲）。其中放线菌门在试验组之间存在显著性差异。

通过组间差异显著性检验可知，在目水平上，弧菌目最多，然后是红杆菌目、黄杆菌目以及交替单胞菌目（图12）。其中，1%菊芋全粉试验B组对虾肠道弧菌目相对丰度比例显著低于其他试验组，并且其红杆菌目、黄杆菌目和交替单胞菌目相对丰度显著高于其他试验组（P＜0.05）。这可能是因为菊芋全粉可以增加物种丰富度，调节肠道菌群平衡；但同样添加了1%菊芋全粉的试验D组却没有这种现象。

3 讨论

3.1 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长性能的影响 有关益生元、益生菌对凡纳滨对虾生长性能影响的研究有很多。但是影响效果报导不一。例如，Li等（2018）研究表明，益生元可以提高对虾生长速度；Boonmee等（2015）试验得出，益生元、益生菌可以使对虾高产的结论；Widagdo等（2012）试验结果表明，益生元可以提高对虾存活率。而Bolívar等（2013）试验报道，益生元、益生菌对生长性能无影响；Li等（2007）也得出了益生元不能提高对虾增重率，饲料转化率和存活率的结论；Anuta等（2016）发现，益生元对增重率、存活率的影响不显著。这可能与益生元的种类、使用方法或对虾的品种、大小和饲养方式等有关。本研究结果表明，饲料中添加108cfu/g地衣芽孢杆菌可以显著提高对虾存活率；饲料中分别添加了1%菊芋全粉和108cfu/g地衣芽孢杆菌的两个试验组均可显著提高对虾的饲料利用率。和对照A组相比，试验组最终体重和特殊生长率没有显著性差异。并且试验中菊芋全粉与地衣芽孢杆菌没有表现出协同作用。这与Li等（2009）的结果一致，具体机理需要进一步研究分析。

3.2 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾免疫力的影响 集约化的对虾养殖，极易感染多种致病菌，使对虾养殖业停滞不前。因为甲壳动物缺乏特异性免疫，所以在清除病原体的免疫过程中，非特异性免疫的作用至关重要（Mithieux，2018）。THC数量可以一定程度上体现机体的细胞免疫水平（陈效儒，2009；Jiang 等，2004）。 本研究中分别添加1%菊芋全粉和108cfu/g地衣芽孢杆菌可以适当增加THC数量，但没有显著性差异。二者的联合使用却可以显著增加THC数量，这表明二者具有协同作用。尽管菊粉和地衣芽孢杆菌增加THC数量的机理尚不明确，但是试验结果显示，二者确实可以通过增加血细胞数量来提高对虾的免疫反应。呼吸爆发（RB）是吞噬细胞清除病原体时的免疫机制，已广泛作为评估非特异性免疫防御病原体的指标。本研究中1%菊芋全粉对RB没有影响。108cfu/g地衣芽孢杆菌可以显著提高对虾RB；1%菊芋全粉与108cfu/g地衣芽孢杆菌联合使用具有一定的协同作用，可以进一步提高RB，但没有显著性。这一结果与郑玉等 （2017）和Zhang等（2011）的结论相似。凡纳滨对虾的代谢活动会产生大量活性氧损伤机体，所以对虾的T-AOC活性与免疫健康息息相关 （Wu等，2014；张克烽等，2007）。LZM可以水解革兰氏阳性菌细胞壁中的乙酰氨基多糖，因此可作为对虾非特异性免疫功能的指标。本研究中1%菊芋全粉与108cfu/g地衣芽孢杆菌都能够显著性增强T-AOC和LZM活性，但是二者联合使用没有明显的协同作用。这与张月（2017）、Zhang等（2011）的结果相似。 然而，菊芋全粉和地衣芽孢杆菌在凡纳滨对虾免疫性能上影响的机理还需要进一步的试验阐明。

3.3 菊芋全粉与芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物的影响 本研究使用Illumina Miseq高通量测序技术对凡纳滨对虾的肠道生物群落进行分析，发现变形菌门、拟杆菌门、放线菌门为对虾肠道内的优势菌群，这一发现与裴鹏兵等（2018）的结果吻合。其中变形菌中相对丰度最高的是弧菌目，包括80多种细菌，多为机会致病菌，而像霍乱弧菌、副溶血性弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌等都是对虾养殖中的易感病原菌。本研究结果表明添加1%菊芋全粉可以显著降低弧菌目的相对丰度，同时显著促进红杆菌目、黄杆菌目的生长，大幅度调节肠道菌群平衡，此结果与Yamazaki等（2016）的研究结果一致。而108cfu/g地衣芽孢杆菌组与对照组相比菌群丰度差异较小，可知单独添加地衣芽孢杆菌无法有效调节对虾的肠道，这可能与地衣芽孢杆菌无法在对虾肠道中有效定植有关（Zhang等，2011）。同时添加了1%菊芋全粉与108cfu/g地衣芽孢杆菌的试验组可以降低弧菌目的相对丰度，促进红杆菌目生长，但是效果不显著，二者之间的协同作用不明显，可能与养殖时间过短有关系。另外，本研究还发现红杆菌目的比例与对虾特殊生长率成正相关，这与Jia等（2019）得出红杆菌可以促进水产生物生长速度的结论一致，这可能是因为红杆菌可以产生聚羟基丁酸酯，进而促进对虾的生长。然而其作用机理尚无合理解释，菊芋全粉与地衣芽孢杆菌影响肠道菌群的作用机制需要进一步的试验解析。本研究结果显示不同的试验组间对凡纳滨对虾的肠道菌落丰富度、均匀度和多样性尽管有一定影响，但是不显著。在纲水平上添加了1%菊芋全粉的试验组具有更多样的生物群落。这与Dimitroglou等（2010）利用甘露寡糖可以增加金头鲷肠道菌群丰富度和多样性的结果相似。也有研究表示益生元会使鲷鱼肠道菌群丰富度降低（Cerezuela等，2013）。实际上，益生元和益生菌的实际功效受多种因素影响，其来源、用量和使用方法的不同，应用对象的种类、年龄以及养殖条件的差异均可影响最终效果。然而，其作用机理复杂，需要进一步探讨。

4 结论

108cfu/g地衣芽孢杆菌可以显著提高对虾的存活率和饲料利用率，同时可以提高T-AOC和LZM的活性；1%菊芋全粉和108cfu/g地衣芽孢杆菌联合使用可以显著提高THC与RB能力。另外，饲料添加剂对凡纳滨对虾肠道微生物的α多样性有一定影响；与对照组相比，试验组之间的菌落组成更为同源，这说明饲料添加剂可以显著的改变肠道菌群物种丰度。综上所述，菊芋全粉与地衣芽孢杆菌均可在不同程度上调节对虾肠道菌群，在免疫活性的提高上具有一定的协同促进效果，因此它们具备作为对虾免疫增强剂的潜在价值。