菊芋叶多酚的超声辅助提取及抗氧化活性研究

马 剑，张宏志，王 愈，梁明祥，边道刚，马艳弘,*

（1. 江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2. 山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；3. 南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京 210095；4. 徐州双信食品有限公司，江苏 徐州 221744）

菊芋（Helianthus tuberosusL.）俗称洋姜、鬼子姜、五星草，为菊科（Compositae）向日葵属（HelianthusL.）多年生草本植物，原产于北美洲，17 世纪传入欧洲，后传入中国，之后在我国大面积种植[1]。菊芋全身是宝，其块茎营养丰富，富含菊糖、酚酸、倍半萜内酯类化合物等功能成分，具有降血糖、改善肠道微生物环境、调节免疫系统等功能[2-3]，在食品医药等领域被广泛应用；其叶片富含黄酮、多酚、菊糖、绿原酸等生物活性物质[4-5]，具有抗氧化、杀虫抑菌、抑制肿瘤细胞增殖等功效[6-10]。

我国菊芋资源丰富，有关菊芋的研究大多围绕其块茎进行，如制备乳酸菌饮料[11]、菊粉[12]、菊芋浓缩汁[13]等产品，对于菊芋叶的研究却相对较少，造成了菊芋叶资源的极度浪费。袁晓艳等[4]报道了菊芋叶中含有丰富的酚类、黄酮、酚酸类化合物，具有极高的开发利用价值。本文以菊芋叶为原料，采用超声辅助的方法提取菊芋叶中的多酚[14-15]，并通过响应面法设计优化菊芋叶多酚的提取工艺[16-17]，同时对提取物的体外抗氧化活性进行研究，为菊芋的全价利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

菊芋叶：由江苏碧青园海洋生物科技有限公司提供。

没食子酸、无水乙醇、碳酸钠、氢氧化钠（均为分析纯试剂）：购自南京寿德试验器材有限公司；羟自由基试剂盒、抗超氧阴离子自由基试剂盒、2×10-4mol/L DPPH 溶液：均购自南京建成生物技术有限公司。

1.1.2 仪器与设备

D-B5 型紫外可见分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；TGL-16B 型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；RE6000 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ZD-F12 型真空冷冻干燥机：南京载智自动化设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菊芋叶多酚提取工艺流程

新鲜菊芋叶→烘干（60 ℃，24 h）→粉碎、过筛（80目）→菊芋叶干粉（含水量＜5%）→超声辅助提取（50%乙醇溶液）→离心（4 000 r/min，20 min）→提取液真空浓缩→AB-8 大孔树脂纯化→真空冷冻干燥→菊芋叶多酚冻干粉

1.2.2 菊芋叶多酚提取的单因素试验设计

1.2.2.1 料液比对菊芋叶多酚得率的影响

以菊芋叶冻干粉为原料，分别以料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），使用50%乙醇溶液于500 W 超声功率条件下提取50 min，考察料液比对菊芋叶多酚得率的影响。

1.2.2.2 乙醇浓度对菊芋叶多酚得率的影响

以菊芋叶冻干粉为原料，乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%，以料液比1∶20（g/mL）于500 W 超声功率条件下提取50 min，考察乙醇浓度对菊芋叶多酚得率的影响。

1.2.2.3 超声时间对菊芋叶多酚得率的影响

以菊芋叶冻干粉为原料，使用50%乙醇溶液为提取剂，按照料液比1∶20（g/mL），以500 W 超声功率分别提取10、20、30、40、50、60 min，考察超声时间对菊芋叶多酚得率的影响。

1.2.2.4 超声功率对菊芋叶多酚得率的影响

以菊芋叶冻干粉为原料，使用50%乙醇溶液为提取剂，按照料液比1∶20（g/mL），在超声功率分别为200、300、400、500、600、700 W 条件下提取50 min，考察超声功率对菊芋叶多酚得率的影响。

1.2.3 响应面优化试验设计

根据Box-Behnken 试验设计原理，在单因素试验的基础上采用四因素三水平的响应面分析法进一步优化多酚提取条件。以料液比、乙醇浓度、超声时间、超声功率为自变量，依次用X1、X2、X3、X4表示，并以-1、0、1 分别代表各自的低、中、高水平，以多酚得率Y（mg/g）为响应值，确定这4 个自变量对菊芋叶多酚得率的影响，同时得到菊芋叶多酚提取的最佳工艺条件。试验因素及水平编码见表1。

表1 因素及水平编码表Table 1 Factors and levels for Box-Behnken design

1.2.4 菊芋叶多酚得率

配制浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的没食子酸标准溶液，分别吸取1 mL 上述标准溶液，加入5 mL 蒸馏水，1 mL 福林酚显色剂，3 mL 质量分数7.5%的碳酸钠溶液，混匀，在45 ℃水浴锅中水浴90 min，最后在波长760 nm 处测定吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程为：y=0.005 6x-0.035 3，R2=0.998 2。根据标准曲线计算多酚含量，再按照如下公式计算多酚得率。

式中：C 为比色杯中多酚质量浓度，mg/mL；V 为多酚提取液总体积，mL；m 为称取的菊芋叶质量，g。

1.2.5 菊芋叶多酚抗氧化活性检测

1.2.5.1 羟自由基（·OH）清除能力

根据参考姬妍茹等[18]和Shen 等[19]的方法，配制浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的样品溶液，根据羟自由基测定方法，以无水乙醇为空白对照，将分光光度计调零，同时以相同浓度的VC 溶液作阳性对照，分别测定其吸光度。·OH 清除率的计算公式如下：

式中：Ai为1 mL 硫酸亚铁溶液+ 1 mL 水杨酸溶液+1 mL 样品液+1 mL 0.5% H2O2溶液在526 nm 处的吸光度；Aj为1 mL 硫酸亚铁溶液+ 1 mL 水杨酸溶液+1 mL 样品液+1 mL 蒸馏水在526 nm 处的吸光度；A0为1 mL 硫酸亚铁溶液+ 1 mL 水杨酸溶液+1 mL 蒸馏水+1 mL 0.5% H2O2溶液在526 nm 处的吸光度。

1.2.5.2 超氧阴离子自由基（O2·）清除能力

根据参考Ding 等[20]的方法，配制浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的样品溶液，按照试剂盒说明书操作，以无水乙醇为空白对照，将分光光度计调零，同时以相同浓度的VC 溶液作阳性对照，分别测定其吸光度。超氧阴离子自由基清除能力计算公式为：

式中：A0为对照组在520 nm 处的吸光度；Ai为样品在520 nm 处的吸光度；Aj为标准品在520 nm 处的吸光度；C 为标准品浓度，mg/mL。

1.2.5.3 DPPH 自由基（DPPH·）清除能力

根据参考Zhu 等[21]的方法，配制浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的样品溶液，各取2 mL 于具塞试管中，再加入1 mL 2×10-4moL/L 的DPPH 溶液，摇匀后避光放置30 min。以无水乙醇为空白对照，将分光光度计调零，同时以相同浓度的VC溶液作阳性对照，分别测定550 nm 处的吸光度。

式中：Ai为2 mL 样品溶液+ 2 mL DPPH 溶液在550 nm 处的吸光度；Aj为2 mL 样品溶液+ 2 mL 无水乙醇在550 nm 处的吸光度；A0为2 mL DPPH 溶液+2 mL 无水乙醇溶液在550 nm 处的吸光度。

1.2.6 数据处理

每组试验进行3 次重复，试验数据采用Excel 2010 软件作图，Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面试验设计，SPSS 2007 软件计算菊芋叶多酚IC50值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对菊芋叶多酚提取效果的影响

料液比是决定菊芋叶多酚得率的重要因素之一。由图1 可知，随着提取剂用量的增大，多酚得率也相应提高，当料液比达到1∶20（g/mL）之后多酚得率变化趋于平缓。由于提取剂用量较低时，菊芋叶中的多酚不能充分溶解；随着提取剂用量的增大，溶剂对多酚的溶解逐渐趋于饱和，当料液比达到1∶20（g/mL）时，多酚得率接近最大值，为35.07 mg/g。与实际生产相联系，选择最佳料液比为1∶20（g/mL），既有利于菊芋叶多酚的提取，又有利于降低生产成本。

图1 料液比对菊芋叶多酚得率的影响Fig.1 Effect of material-liquid ratio on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.1.2 乙醇浓度对菊芋叶多酚提取效果的影响

由图2 可知，当乙醇浓度在30%～50%时，多酚得率随着乙醇浓度的增加而升高；当乙醇浓度为50%时，菊芋叶多酚得率达到最高，为20.85 mg/g；之后随着乙醇浓度的增加，菊芋叶多酚得率逐渐降低，这是由于高浓度乙醇溶液会使蛋白质变性，影响多酚类物质的溶出，菊芋叶多酚得率降低。因此确定菊芋叶多酚最佳提取乙醇浓度为50%。

图2 乙醇浓度对菊芋叶多酚的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.1.3 超声时间对菊芋叶多酚提取效果的影响

由图3 可知，当超声处理时间在10～50 min 时，菊芋叶多酚得率随着超声时间的延长而不断升高；当超声时间为50 min 时，多酚得率达到最大值，为50.65 mg/g；当超声时间大于50 min 时，菊芋叶多酚得率开始降低。由于超声时间的延长，超声波会导致提取液温度升高，使多酚稳定性降低，得率减小。故选择超声时间50 min 作为最佳提取时间。

图3 超声时间对菊芋叶多酚得率的影响Fig.3 Effect of ultrasound time on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.1.4 超声功率对菊芋叶多酚提取效果的影响

由图4 可知，随着超声功率的增大，菊芋叶多酚得率先增大后减小。当超声功率为500 W 时，菊芋叶多酚得率接近最大值，为34.31 mg/g；超声功率大于600 W 之后，菊芋叶多酚得率降低。由于随着超声功率的增大，热效应也在增强，很容易造成多酚分子结构的破坏，使得菊芋叶多酚得率降低。因此，确定超声功率500 W 为最佳提取功率。

图4 超声功率对菊芋叶多酚得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.2 响应面法优化提取菊芋叶多酚

2.2.1 响应面试验方案及结果

在单因素试验的基础之上，进行料液比（X1）、乙醇浓度（X2）、超声时间（X3）、超声功率（X4）与菊芋叶多酚得率之间的四因素三水平的响应面优化试验，结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

续表2 响应面试验设计及结果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 响应面数学模型的建立与方差分析

使用Design-Expert 8.0.6 软件对表2 中的响应面数据进行二次多项式回归拟合，以料液比（X1）、乙醇浓度（X2）、超声时间（X3）、超声功率（X4）为自变量，菊芋叶多酚得率（Y）为响应值，建立二次多元回归方程：Y=31.37-0.37X1+0.75X2-0.75X3-0.25X4-3.28X1X2-4.55X1X3+0.27X1X4+0.22X2X3-0.009 75X2X4-0.79X3X4-3.28X12-3.89X22-2.98X32-3.72X42。

对响应面回归模型进行方差分析，结果见表3。

由表3 可知，该数学模型回归极显著（P＜0.000 1），失拟项P=0.577 3＞0.05，不显著；试验值与预测值有着高度的相关性（R2=0.995 2，R2adj=0.990 3），说明该数学模型与试验拟合较好，试验误差较小，故可以用于菊芋叶多酚得率的理论推测。由F 检验可以判断得到各个变量对菊芋叶多酚得率的影响大小顺序为：超声时间（X3）＞乙醇浓度（X2）＞料液比（X1）＞超声功率（X4）。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

2.2.3 各因素交互作用分析

等高线可以直观地反映各因素对菊芋叶多酚提取效果的交互作用程度，等高线呈圆形表示两因素交互作用不显著，而呈椭圆形则表示两因素交互作用显著。从表3 和超声辅助提取菊芋叶多酚的等高线和响应面图（图5～7）可知，X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X3X4、X12、X22、X32、X42对多酚得率的影响达到了极显著水平（P＜0.01），X4对多酚得率的影响达显著水平（P＜0.05）。表明料液比与乙醇浓度、料液比与超声时间、超声时间与超声功率之间的交互作用极显著（P＜0.01）。

图5 料液比与乙醇浓度的交互作用对多酚得率影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots of the effect of the interaction between material-liquid ratio and ethanol concentration on polyphenol yield

图6 料液比与超声时间的交互作用对多酚得率影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots of the effect of the interaction between material-liquid ratio and ultrasonic time on polyphenol yield

图7 超声时间与超声功率的交互作用对多酚得率影响的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots of the effect of the interaction between ultrasonic time and ultrasonic power on polyphenol yield

2.2.4 验证试验

根据Design-Expert 8.0.6 统计分析软件得到，超声辅助提取菊芋叶多酚的最佳提取条件为：料液比1∶19.52（g/mL），乙醇浓度51.36%，超声时间49.57 min，超声功率496.70W，在此条件下多酚得率为31.46mg/g。为了操作方便，修正最佳提取条件为：料液比1∶20（g/mL），乙醇浓度50%，超声时间50 min，超声功率500W，在此条件下，得到菊芋叶多酚得率为31.18mg/g，与模型预测值之间的相对误差仅为0.89%，因此证明该模型合理，试验结果较准确。

2.3 菊芋叶多酚抗氧化活性检测结果

2.3.1 菊芋叶多酚的羟自由基清除能力

由图8 可知，菊芋叶多酚具有一定的·OH 清除能力，其对·OH 的清除率随着浓度的升高而增大，呈现量效关系，1.2 mg/mL 菊芋叶多酚对羟自由基的清除能力达90.39%；相同浓度下菊芋叶多酚对·OH的清除率略低于VC，菊芋叶多酚和VC 的IC50值分别为0.268 mg/mL 和0.211 mg/mL。

图8 菊芋叶多酚对羟自由基的清除作用Fig.8 The removal of hydroxyl free radicals by jerusalem artichoke leaves polyphenols

2.3.2 菊芋叶多酚的抗超氧阴离子自由基能力

由图9 可知，菊芋叶多酚具有较强的抗O2·能力，当菊芋叶多酚浓度从0.2 mg/mL 增大至1.2 mg/mL时，其抗O2·活力由10.62 U/L 提高到45.66 U/L，同一浓度菊芋叶多酚的抗O2·能力明显高于VC。与VC 相比，1.2 mg/mL 菊芋叶多酚的抗O2·能力提高了59.26%。可见，菊芋叶多酚的抗O2·活力显著高于VC（P＜0.05）。

图9 菊芋叶多酚对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.9 The removal of super-oxygen anions radicals (O2·) by jerusalem artichoke leaves polyphenols

2.3.3 菊芋叶多酚的DPPH 自由基清除能力

由图10 可知，菊芋叶多酚对DPPH·有很强的清除作用，且其清除能力具有一定的量效关系，1.2 mg/mL菊芋叶多酚对DPPH·的清除能力达93.27%；在同一浓度下，菊芋叶多酚的DPPH·清除能力与VC 的DPPH·清除能力之间无显著差异，二者的IC50值分别为0.014 mg/mL 和0.020 mg/mL。

图10 菊芋叶多酚对DPPH·的清除作用Fig.10 The removal of DPPH free radicals by jerusalem artichoke leaves polyphenols

3 结论

本研究以菊芋叶为原料，采用超声辅助法提取菊芋叶中的多酚，在单因素试验的基础上，通过响应面设计优化了菊芋叶多酚的提取工艺，并且测定其抗氧化能力。结果表明，各因素对菊芋叶多酚得率影响的大小顺序为：超声时间（X3）＞乙醇浓度（X2）＞料液比（X1）＞超声功率（X4）；菊芋叶多酚的最佳提取工艺条件为：料液比1∶20（g/mL），乙醇浓度50%，超声时间50 min，超声功率500 W，在此工艺条件下，菊芋叶多酚得率为31.18 mg/g；菊芋叶多酚有较强的抗氧化能力，1.2 mg/mL 菊芋叶多酚的·OH、DPPH·清除率以及抗O2·活力分别达90.39%、93.27%、45.66 U/L，尤其是其抗O2·能力，与同浓度的VC 相比提高了59.26%。可见，超声辅助提取菊芋叶多酚具有得率高、抗氧化能力强等优点，可为菊芋叶的综合利用提供理论依据和技术参数。