湘西“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草总黄酮的提取及抑菌活性研究

陈加蓓，李 贵，3，魏 华，陈功锡

(1.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首 416000；2.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000；3.中南大学生命科学学院，湖南长沙 410078)

鼠麴草(Gnaphalium affineD.Don)是菊科Compositae鼠麴草属Gnaphalium一年生草本植物.作为我国传统中草药及湘西民族传统特色食品“蒿菜粑粑”原料植物，鼠麴草广泛分布于我国台湾、华东、华南、华中、华北、西北及西南各省区，其茎叶为镇咳、祛痰、治气喘和支气管炎以及非传染性溃疡、创伤之常用药，内服还有降血压等疗效[1-3].鼠麴草还具有抗组胺、抗细菌和真菌、抗氧化、抗心衰、平喘、抗黄嘌呤氧化酶、光防护、抗补体和保肝等生物活性[4].研究表明鼠麴草具活性的主要化学成分有黄酮类、苷类、氨基酸、三萜类、植物甾醇和咖啡酸衍生物等[4-5].本课题组前期研究发现该植物的醇提取部位，主要含有黄酮类化合物.鼠麴草中的黄酮类成分为其抗炎、抗氧化作用主要活性成分之一[6-8].黄酮类成分的提取主要有微波提取法、超声波提取法、回流提取法等方法.微波提取法具有提取速度快，提取效率高等特点；微波提取的响应面法具有实验次数少，时效性好、统计分析全面、选择性广、预测精度较高等优点；K-B纸片抑菌法具有重复性较好、操作简便、试验成本相对较低、结果直观等优点[9].湘西地区处于生物多样性及其丰富的武陵山区，“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草资源丰富，鼠麴草黄酮类等有效成分的资源和分布等并不清楚.因此，这一具有民族特色的地区“蒿菜粑粑”原料植物具有极大的经济社会价值和应用前景.本研究主要以“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草为材料，拟通过单因素实验及响应面法优化其总黄酮的微波提取工艺，并通过K-B纸片法对其抑菌活性展开研究，为具经济社会价值的湘西“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草的综合开发和循环应用提供科研基础.

1 材料

1.1 仪器设备

EXCEL-2010微波化学工作平台(上海屹尧仪器科技发展有限公司)；LE204E/02电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；BSC-04IIB2生物安全柜(苏净集团安泰公司)；XMTD-7000型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；UV-2600紫外可见分光光度计[岛津仪器(苏州)有限公司]；KQ-250DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；RE-2000A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SPX-250Bш型生化培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；MLS-3780型高压蒸汽灭菌器(SANYO公司)等.

1.2 材料与试剂

“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草地上部分，于2019年4月采自湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市，凭证标本材料存于吉首大学生物资源与环境科学学院植物标本馆.将所采新鲜鼠麴草洗净晾干后于50℃恒温干燥，粉碎，过30目筛，装袋备用.

芦丁对照品:中国食品药品检定研究院，批号:10080-201811；无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯化钠、葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯试剂；牛肉膏、蛋白胨、琼脂，为生化试剂；实验用水为去离子水.

6种抑菌指示菌分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisATCC 6051)、大肠埃希菌(Escherichia coliATCC 128)、变形杆菌(Proteus vulgarisATCC 8427)、藤黄八叠球菌(Sarcina luteaCGMCC 1.880)、白色念珠菌(Canidia albicansNCPC 1027)和黑曲霉(Aspergillus nigerNCPC 1003)均由吉首大学微生物资源与生态实验室提供.

2 方法

2.1 总黄酮标准曲线的制备

准确称取20.30 mg芦丁标准品，置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解定容，制成浓度为186.62 mg/L的芦丁标准使用溶液.参照文献方法[10-11]稍作调整，取7支试管依次加入芦丁标准使用溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，制备总黄酮标准曲线，以芦丁标准液浓度C为撗坐标，吸光度A为纵坐标，得回归曲线方程为吸光度A ＝0.0166C-0.0231，r2＝ 0.9987，表明在0.00～80.94 mg/L范围内，总黄酮的质量浓度与A值呈良好的线性关系.

2.2 鼠麴草总黄酮供试品溶液的制备

鼠麴草总黄酮的提取:精密称取0.2000 g样品于微波提取罐中，加入一定浓度乙醇溶液，置微波工作平台中，进行微波辅助提取，趁热过滤，用70%乙醇定容至25 mL，摇匀，即制得鼠麴草总黄酮提取供试品溶液.

2.3 鼠麴草供试品溶液中总黄酮的测定

总黄酮得率的计算:

吸取2.2项制备的鼠麴草总黄酮供试品溶液1.0 mL置于50 mL容量瓶中，加水补充至10 mL，后续方法与“2.1”项步骤相同.在506 nm波长处测定供试品溶液的吸光度A值，通过芦丁标准回归方程，计算供试品溶液中总黄酮的浓度C与样品中总黄酮得率W.

式中:W—供试样品中总黄酮的得率(%)，C—供试品溶液中总黄酮的浓度(mg/L)，n—稀释倍数，V—供试品溶液定容体积(mL)，m—样品质量(g).

2.4 单因素实验

微波提取:取鼠麴草样品粉末0.2000 g，固定其他条件，分别考察单因素液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，mL∶g)、乙醇浓度(10%、30%、50%、70%、90%)、微波提取时间(4 min、6 min、8 min、10 min、12 min)、微波提取温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)对总黄酮得率的影响.

2.5 响应面实验

在单因素实验结果基础上，采用响应面法对鼠麴草总黄酮提取工艺进一步优化，以液料比、乙醇浓度、微波提取时间为自变量，按照Box-Behnken中心组合设计响应面优化方案，选取3因素3水平的组合(表1).

表1 响应面实验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2.6 抑菌实验

2.6.1 鼠麴草抑菌供试品溶液的制备

鼠麴草乙醇提取液的制备:称取鼠麴草材料粉末15.0 g，加入浓度95%乙醇150 mL，65℃、250 W 超声提取30 min后，静置过夜、过滤.滤渣同等条件超声重提2次，再过滤.合并滤液，浓缩至无醇味，且均配成1.5 mL溶液.

鼠麴草提取物分极性部位萃取液的制备:称取75.0 g鼠麴草材料粉末，加入500 mL浓度为70%的乙醇，在55℃、250 W超声条件下，提取30 min后，静置过夜、过滤.滤渣同等条件超声重提2次，再过滤.滤液合并，浓缩至无醇味，配成75 mL溶液，且均分成5等份，分别用等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取2次，合并2次萃取液，再分别将萃取液浓缩至1.5 mL溶液.水部位依次用等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，加入等体积的水，再将其浓缩至1.5 mL.

2.6.2 培养基制备

细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌培养基采用PDA培养基[12]，所有培养基均采用121℃高压灭菌20 min后备用.其余抑菌实验相关操作均在吉首大学微生物资源与生态实验室进行.

2.6.3 菌种活化

以划线法分别将供试细菌枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、变形杆菌、藤黄八叠球菌从试管斜面转接到牛肉膏蛋白胨斜面固体培养基上.37℃恒温培养24～48 h，连代培养2次，使菌体达到最佳生长状态，备用.将供试的黑曲霉及白色念珠菌从试管斜面以划线法转接到PDA斜面固体培养基上，28℃恒温培养3～5 d，连代培养2次，使菌体达到最佳生长状态，备用.

2.6.4 带菌平板的制备

用接种环挑取少量的试验菌种，接入到装有培养基的锥形瓶，震荡摇匀，使菌种分布均匀，进行倒平板，备用.

2.6.5 基于药敏滤纸片法的抑菌实验

根据K-B纸片抑菌法，将已灭菌好的直径为6 mm的滤纸片按1层贴于各带菌平板上，将供试品乙醇提取液、各部位萃取液用移液枪分别移取10 μL提取液于1层纸片，置于一个带菌平板，保持间隔并做好标记，细菌于37℃培养1～3天、真菌于28℃培养3～5天后观察和测定抑菌圈直径.每组抑菌实验3个平行.以无菌水与提取液及萃取液作为对照.

2.7 数据分析

使用Excel 2010对实验数据进行初步分析、整理、制表与制图，采用响应面分析软件Design Expert.10.0对实验的结果进行分析，并绘制响应面图.

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 液料比对鼠麴草总黄酮得率的影响

在乙醇体积分数70%、微波时间6 min、微波温度50℃条件下，比较不同液料比对鼠麴草总黄酮得率的影响如图1所示:

图1 液料比对鼠麴草总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of liquid to material ratio on total flavonoids yield from Gnaphalium affine

由图1可知，在考察范围内，鼠麴草总黄酮得率随着液料比的增大呈倒S型缓慢增加.具体而言，液料比为30∶1较20∶1快速增长，液料比40∶1整体持平，50∶1略低，液料比60∶1升高.综合考虑乙醇使用量及回收成本，初步确定液料比30∶1较合适.

3.1.2 乙醇浓度对鼠麴草总黄酮得率的影响

在液料比30∶1、微波时间6 min、微波温度50℃条件下，比较不同乙醇浓度对鼠麴草总黄酮得率，其影响情况如图2所示:

由图2可知，乙醇浓度50%时鼠麴草总黄酮得率最大，乙醇浓度＞50%或者＜50%时，鼠麴草总黄酮得率均出现明显下降.根据相似相溶理论，此乙醇浓度极性可能和鼠麴草黄酮化合物相近，故溶出效果较好.

3.1.3 提取时间对鼠麴草总黄酮得率的影响

在乙醇浓度70%、液料比30∶1、微波温度50℃条件下，考察不同提取时间鼠麴草总黄酮得率的影响，结果如图3所示:

由图3可知，随着提取时间的增长，鼠麴草总黄酮得率先增大，当提取时间＞8 min时，鼠麴草总黄酮得率下降，说明提取时间过短提取不充分，提取时间过长总黄酮成分被破坏，使显色结果降低，故8 min应为较适合的提取时间.

图2乙醇浓度对鼠麴草总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield from Gnaphalium affine

图3 提取时间对鼠麴草总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on total flavonoids yield from Gnaphalium affine

3.1.4 提取温度对鼠麴草总黄酮得率的影响

在乙醇浓度70%、液料比30:1、微波时间6 min的条件下，比较不同提取温度对鼠麴草总黄酮得率的影响，其结果如图4所示.

图4 提取温度对鼠麴草总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on total flavonoids yield from Gnaphalium affine

由图4可知，随着提取温度的升高，鼠麴草总黄酮得率逐渐增大，50℃以后，提取得率变化不明显且趋缓.基于节能环保等方面综合考虑，故50℃应为鼠麴草总黄酮较合适的提取温度条件.

3.2 响应面结果

3.2.1 响应面实验结果

由表2可知，一次项A、C和2次项B2、C2有极强的显著性.2次项为显著项.可见2次项B2、C2与响应值有很大的联系，2次项A2与响应值有一定联系，不仅是简单的线性关系.一次项B和交互项AC、AB、BC为不显著项.同时，通过F值可判断单因素中影响得率主次顺序为:A(液料比)＞C(提取时间)＞B(乙醇浓度).失拟误差P＝0.3346＞0.05，差异不显著.模型的决定系数R2为0.9430，表明该模型拟合程度好，误差较小，可以用来分析和预测不同提取工艺条件下鼠麴草总黄酮得率的最佳理论值.由表3方差分析可知，该实验数据所建立的模型的F值为12.88，P＝0.0014＜0.05，该模型具有显差异著，其拟合出的回归方程为:Y＝3.056+0.0975A-0.015B+0.075C-0.0475AB-0.0125AC-0.0375BC+0.06575A2+0.12075B2+0.14075C2

方程式中A、B、C分别为液料比、乙醇浓度、提取时间.

表2 鼠麴草总黄酮提取响应面实验方案及结果Table 2 Experimental scheme and results of total flavonoids from Gnaphalium affine extraction for response surface

表3 响应面ANOVA分析结果Table 3 ANOVA analysis results of response surface

3.2.2 响应面交互作用分析结果

通过对三维响应面图分析可知(如图5所示)，液料比与乙醇浓度、液料比与提取时间、乙醇浓度与提取时间交互作用对应的等高线椭圆度较小，说明液料比、乙醇浓度、提取时间之间的交互作用相对较弱.

3.2.3 鼠麴草中黄酮提取的最佳条件验证性实验

经响应面优化，鼠麴草中总黄酮最佳提取工艺为:液料比(v/m)7∶1，乙醇浓度40%，提取时间9min.根据所拟合的最佳条件进行验证实验，重复3次，取平均值，结果为3.62%，与预测值3.643%相差0.63%，表明该条件可信，模型准确，重现性良好.

图5 鼠麴草总黄酮提取工艺优化响应面3D图Fig.5 Optimized response surface 3D map of extraction process of total flavonoids from Gnaphalium affine

3.3 抑菌实验

3.3.1 鼠麴草乙醇提取液抑菌活性

由表4可知，总体来看，“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草乙醇提取液对藤黄八叠球菌、大肠埃希菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌均具有较好抑菌效果，空白对照组水与95%乙醇对所有菌种均无抑菌效果.根据药敏试验标准[13]判定鼠麴草乙醇提取液对藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌具有高敏抑菌效果，对大肠埃希菌、变形杆菌、白色念珠菌的抑菌效果为中敏，对黑曲霉具较低敏的抑菌活性.

表4 鼠麴草乙醇提取液抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of ethanol extract from Gnaphalium affine

3.3.2 鼠麴草各极性部位萃取液抑菌活性

总体来看“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草各极性部位萃取液对藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌等6种实验用菌均有较好抑菌效果，无菌水与各萃取剂均无抑菌效果.分部位看，抑菌部位主要集中在正丁醇部位、二氯甲烷部位与乙酸乙酯部位，石油醚部位与水部位无抑菌效果，正丁醇部位与二氯甲烷部位对藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均有抑菌效果，乙酸乙酯部位只对藤黄八叠球菌、白色念珠菌有抑菌效果，以正丁醇部位抑菌种类最多，相对效果最佳.通过特征性显色反应发现正丁醇部位总黄酮含量最高.根据药敏试验判定标准[13]，正丁醇部位与二氯甲烷部位对藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌仅仅具有低敏抑菌活性，乙酸乙酯部位对藤黄八叠球菌、白色念珠菌也仅为低敏抑菌活性(表5).

表5 鼠麴草各极性部位萃取液抑菌活性Table 5 Antibacterial activity of extracts of various polar parts from Gnaphalium affine

4 讨论与结论

本研究通过单因素和响应面实验对鼠麴草总黄酮的提取工艺进行系统研究，确定了总黄酮的微波提取最佳工艺条件为液料比7∶1，乙醇浓度40%，提取时间9 min.验证实验总黄酮得率为3.62%，与模型预测结果相符，表明响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，具有良好的预测性，能有效指导工艺参数的优化.石青浩等[14]对鼠曲草黄酮提取单因素条件进行了初步研究，而侧重在鼠麴草总酮的抗氧化活性方面的研究；本研究则在单因素水平上，进一步运用响应面法对其各因素进行了组合考察，同时在功效研究方面考察了其抑菌活性.

鼠麴草对藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌等6种试验用菌均有较好的抑制效果，体现出具有一定的广谱抑菌活性.其抑菌部位主要集中在正丁醇部位、二氯甲烷部位与乙酸乙酯部位，不同极性部位表现出来的不同抑菌活性，暗示不同极性部位活性成分也不尽相同.这为鼠麴草总黄酮等功能性成分的开发提供了重要的参考依据，也为湘西“蒿菜粑粑”与其原料植物的深入扩展研究和应用奠定重要基础.