MiR-4429/NQO1对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤及炎症因子分泌的影响

周燕 郭珊岚 兰秀君 郑红

641300 资阳，四川省资阳市第一人民医院肾病内科(周燕，兰秀君),病理科(郭珊岚),检验科(郑红)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的并发症之一，肾小管上皮细胞损伤在DN发生过程中发挥重要作用，而肾小管上皮细胞损伤主要包括炎性损伤、细胞凋亡等[1]。研究表明高糖环境可诱导肾小管上皮细胞损伤[2]。目前关于肾小管上皮细胞损伤的分子机制尚未完全阐明，国外研究表明miR-29c、miR-216a-5p等miRNA可通过调控靶基因表达从而参与DN发生及发展过程[3-4]。但仍有部分miRNA在DN发生过程中的作用机制尚未阐明。因而探究其发生机制有助于诊断及治疗DN。miR-4429在DN患者中呈高表达，但关于其具体作用机制尚未阐明[5-6]。生物信息学分析显示依赖还原型辅酶/醌氧化还原酶1(NADH quinone dehydrogenase 1，NQO1)可能是miR-4429的靶基因，研究表明NQO1属于抗氧化基因，并可拮抗高糖诱导的氧化应激反应[7-8]。但miR-4429是否可通过调控NQO1从而参与肾小管上皮细胞损伤过程尚未可知。本研究通过高糖诱导肾小管上皮细胞建立细胞损伤模型，观察细胞中miR-4429与NQO1的表达，分析miR-4429与NQO1对高糖诱导肾小管上皮细胞损伤及炎性因子分泌的影响，旨在为进一步揭示肾小管上皮细胞损伤的分子机制奠定理论基础。

材料与方法

一、材料与试剂

人肾小管上皮细胞HK-2购自上海通派生物科技有限公司；D-葡萄糖购自上海甄准生物科技有限公司；杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher公司；Lipofectamine2000购自上海润成生物科技有限公司；miR-4429特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-4429)及阴性对照序列(anti-miR-NC)、miR-4429寡核苷酸模拟物(miR-4429 mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、NQO1小干扰RNA(si-NQO1)及阴性对照序列(si-NC)购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)购自上海泽叶生物科技有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶细胞凋亡试剂盒购自上海朗智生物科技有限公司；RIPA裂解液购自武汉博士德生物工程有限公司；二喹啉甲酸蛋白定量检测试剂盒购自武汉卡诺斯科技有限公司；增强型化学发光试剂购自北京百奥莱博科技有限公司；兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)抗体购自美国CST公司；兔抗人NQO1抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自武汉艾美捷科技有限公司；丙二醛(malondialedhyde，MDA)含量检测试剂盒与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒购自美国Abnova公司；白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

二、方法

1.细胞转染与实验分组 HK-2细胞培养于DMEM完全培养基，置于37 ℃恒温培养箱培养。取对数期HK-2细胞，0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，调整细胞密度1×104个/mL，按照每孔100 μL的密度接种于6孔板，用含有30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h，记作高糖组(HG组)[9]；用含有5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h，记作正常对照组(Control 1组)；用含有50 mmol/L甘露醇的培养基培养24 h，记作高渗对照组(Control 2组)。取对数期HK-2细胞接种于6孔板，待细胞生长融合度达到70%时，将培养基更换为不含血清的培养基，分别将anti-miR-NC、anti-miR-4429、anti-miR-4429与si-NC、anti-miR-4429与si-NQO1转染至HK-2细胞，使用含有30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h，分别记作HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-4429组、HG+anti-miR-4429+si-NC组、HG+anti-miR-4429+si-NQO1组。转染方法参照Lipofectamine2000试剂说明书，严格按照试剂说明书进行操作。

2.实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测细胞中miR-4429、NQO1 mRNA的表达水平 收集各组肾小管上皮细胞，采用Trizol法提取肾小管上皮细胞中的总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度。miR-4429正向引物5′-TCTCTCCAACTCAGACTGCC-3′，反向引物5′-AAAGCAAGTCAGGGAAGCCT-3′；NQO1正向引物5′-TCCCAGGTTCCAGCAATTCT-3′，反向引物5′-CACTTTGGGAGGCTGAGGTA-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。qRT-PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，cDNA 2 μL，正反向引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6 μL；反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循环。miR-4429以U6为内参，NQO1以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-4429、NQO1 mRNA的相对表达量。

3.MTT检测细胞增殖 收集各组对数期肾小管上皮细胞接种于96孔板(3×104个/孔)，每组设置3个复孔，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃培养箱继续培养4 h，1 300 r/min离心5 min，弃上清液，按照每孔150 μL的密度加入二甲基亚砜(DMSO)，室温避光振荡孵育5 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值，计算细胞存活率，计算公式为：细胞存活率(%)=[(各实验组A值-空白对照组A值)/(正常对照组A值-空白对照组A值)×100%]，实验重复3次。

4.流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组对数期肾小管上皮细胞，1 000 r/min离心6 min，弃上清，预冷PBS洗涤，加入5 μL 膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素，充分混匀，加入5 μL碘化丙啶，室温振荡孵育10 min，置于FACS Calibur流式细胞仪及应用Cellauest软件检测各组细胞凋亡率。

5.检测MDA含量与SOD活性 收集各组对数期肾小管上皮细胞，按照试剂盒说明书分别检测MDA含量与SOD活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。

6.酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-1β、TNF-α浓度 收集各组细胞培养上清液，根据ELISA检测试剂盒检测IL-1β、TNF-α含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

7.双荧光素酶报告基因检测miR-4429的靶基因 starBase预测显示NQO1的3′UTR含有miR-4429的互补序列，将结合位点与突变位点分别插入荧光素酶报告基因载体分别构建野生型载体WT-NQO1与突变型载体MUT-NQO1，分别将WT-NQO1、MUT-NQO1与miR-NC、miR-4429 mimics共转染至肾小管上皮细胞，按照荧光素酶活性检测试剂盒分别检测各组细胞相对荧光素酶活性。参照Lipofectamine2000说明书分别将miR-NC、miR-4429、anti-miR-NC、anti-miR-4429转染至肾小管上皮细胞，通过qRT-PCR与蛋白免疫印迹法(western blot)检测各组细胞中NQO1 mRNA及蛋白表达量。

8.Western blot检测NQO1、Caspase-3蛋白表达 收集各组对数期肾小管上皮细胞，加入蛋白裂解液(1 mL RIPA、1%苯甲基磺酰氟、0.1% 抑肽酶)，冰上裂解30 min，4 ℃条件下12 000 r/min(离心半径6 cm)离心15 min，吸取上清液。采用二喹啉甲酸法检测蛋白浓度。取50 μg蛋白样品加入SDS上样缓冲液，高温煮沸，蛋白变性。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜、封闭，加入NQO1(稀释比1∶1 000)、Caspase-3(稀释比1∶1 000)与内参GAPDH(稀释比1∶2 000)一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗稀释液(稀释比1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，滴加增强型化学发光试剂显影，应用Quantityone软件检测条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。

三、统计学处理

结 果

一、miR-4429、NQO1 mRNA在高糖诱导的肾小管上皮细胞中的表达

与Control 1组、Control 2组相比，HG组细胞中miR-4429的表达水平显著升高(P<0.05)，NQO1 mRNA的表达水平显著降低(P<0.05)。(表1)

表1 miR-4429、NQO1 mRNA在高糖诱导的肾小管上皮细胞中的表达量比较(n=9)

二、抑制miR-4429对高糖诱导的肾小管上皮细胞的细胞存活率及凋亡的影响

与Control 1、Control 2组相比，HG组细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)；与HG+anti-miR-NC组相比，HG+anti-miR-4429组细胞存活率显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。(图1、表2)

注：与Control 1组和Control 2组比较，aP<0.05；与HG+anti-miR-NC组比较，bP<0.05

表2 抑制miR-4429对高糖诱导的肾小管上皮细胞的细胞存活率及凋亡的影响(n=9)

三、抑制miR-4429对高糖诱导的肾小管上皮细胞中氧化应激及炎症因子的影响

相较于Control 1、Control 2组，HG组细胞中MDA、IL-1β、TNF-α水平显著升高(P<0.05)，SOD活性显著降低(P<0.05)；与HG+anti-miR-NC组相比，HG+anti-miR-4429组细胞中MDA、IL-1β、TNF-α水平显著降低(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)。(表3)

表3 抑制miR-4429对高糖诱导的肾小管上皮细胞中炎症因子分泌的影响

四、miR-4429靶向调控NQO1的表达

starBase预测显示NQO1的3′UTR含有miR-4429的互补序列，见图2A。双荧光素酶报告实验结果显示，转染野生型载体WT-NQO1的细胞中，miR-4429组荧光素酶活性显著低于miR-NC组(P<0.05)；转染突变型载体MUT-NQO1的细胞中，miR-4429组与miR-NC组荧光素酶活性相比差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。qRT-PCR与Western blot检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-4429组细胞中NQO1 mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-4429组细胞中NQO1 mRNA及蛋白表达量显著升高(P<0.05)(图2B、表5)。

图2 miR-4429对NQO1靶向调控作用 A.NQO1的3’UTR含有miR-4429的互补序列；B.4组细胞NQO1蛋白的表达情况

表4 双荧光素酶报告实验结果(n=9)

表5 miR-4429调控NQO1的表达(n=9)

五、抑制NQO1联合抑制miR-4429对高糖诱导的肾小管上皮细胞的细胞凋亡、氧化应激及炎症因子分泌的影响

与HG+anti-miR-4429+si-NC组相比，HG+anti-miR-4429+si-NQO1组细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD活性显著降低(P<0.05)，IL-1β、TNF-α水平显著升高(P<0.05)。(图3、表6)

表6 两组细胞存活率、凋亡率、氧化应激及炎症因子比较(n=9)

图3 抑制NQO1联合抑制miR-4429对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡及NQO1、Caspase-3蛋白表达的影响A.两组肾小管上皮细胞凋亡情况；B.两组NQO1、Caspase-3蛋白的表达情况

讨 论

DN的主要病理特征是肾小球病变，而肾功能损伤与肾小球病变密切相关，研究表明肾小管上皮细胞凋亡是促使肾小球病变的重要原因之一，同时炎性损伤与氧化损伤等多种因素也可促使肾小球病变[10]。研究表明miRNA可参与高糖诱导的内皮细胞损伤过程[11]。相关报道指出高糖处理后的肾小管上皮细胞是DN肾小管上皮细胞损伤模型，并可用于体外实验研究[12]。本研究结果显示高糖处理后肾小管上皮细胞凋亡率明显增多，提示成功构建DN肾小管上皮细胞损伤模型。

本研究结果显示高糖处理后肾小管上皮细胞中miR-4429的表达水平明显升高。研究表明miR-4429在急性缺血性中风、肥胖相关疾病中表达上调，并可能参与该疾病发生及发展过程[13-14]。但miR-4429在DN肾小管上皮细胞损伤发生过程中的调控机制尚未可知。本研究结果提示miR-4429表达量升高可能促进DN肾小管上皮细胞损伤的发生进而参与DN的发生过程，进一步分析显示抑制miR-4429表达后可明显抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡，降低Caspase-3表达量，提示抑制miR-4429表达可能通过下调Caspase-3表达来抑制细胞凋亡，从而减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤并减缓DN的发展进程。

有研究表明糖尿病引起的氧化应激反应可加重肾小管上皮细胞损伤，降低MDA含量，增强SOD活性可明显提高细胞抗氧化能力[15]。本研究结果显示，高糖处理后肾小管上皮细胞中MDA含量明显升高，SOD活性明显降低，而抑制miR-4429表达可明显提高SOD活性，减低MDA含量，提示抑制miR-4429表达可减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤。相关报道指出肾小管上皮细胞凋亡与肾脏组织炎症反应密切相关，IL-1β、TNF-α可引起细胞损伤从而间接促进细胞凋亡[16]。本研究结果显示,抑制miR-4429表达可减少高糖环境下肾小管上皮细胞分泌IL-1β、TNF-α，提示抑制miR-4429表达可减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞炎性损伤。

本研究通过生物信息学分析显示NQO1可能是miR-4429的靶基因，进一步分析显示miR-4429能够靶向结合NQO1，并可负向调控NQO1的表达。研究表明NQO1可催化醌类化合物形成水合醌类，还可与葡萄糖醛酸等形成共轭键而稳定存在于细胞中，其发生反应的过程中没有自由基等氧化产物形成从而可保护细胞免受氧化损伤[17]。研究表明上调NQO1表达可减轻视网膜神经节细胞氧化损伤[18]。与上述研究结果相似，本研究结果显示高糖处理后肾小管上皮细胞中NQO1表达量明显降低，提示miR-4429可能通过调控NQO1的表达从而参与肾小管上皮细胞损伤过程。本研究还发现，抑制NQO1表达后可明显减弱抑制miR-4429表达对高糖诱导肾小管上皮细胞的保护作用,提示抑制miR-4429表达可靶向上调NQO1表达从而抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡，提高细胞存活率，减轻炎症损伤，增强细胞抗氧化能力。

综上所述，在高糖诱导的肾小管上皮细胞中，miR-4429表达上调，NQO1表达下调，miR-4429可能靶向调控NQO1的表达从而加重高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤；抑制miR-4429表达可明显减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞炎性损伤及氧化损伤，抑制细胞凋亡，提高细胞存活率，可为揭示DN发生机制提供新方向。