化痰祛瘀汤对失眠大鼠模型的治疗作用及机制

王琪 李延 李勇 吴限

摘要  目的：觀察化瘀祛痰汤对失眠大鼠模型的治疗作用，探讨作用机制。方法：选取40只成年SD大鼠，分为正常对照组、模型对照组、中药观察组和艾司唑仑组。建立对照组之外3组大鼠失眠模型。中药观察组给予化瘀祛痰汤，艾司唑仑组给予艾司唑仑水溶液灌胃，模型对照组和正常对照组均给予同等体积的蒸馏水灌胃。观察各组建模及治疗后行为学变化;比较各组大鼠干预前后自主活动数;比较干预后各组大鼠戊巴比妥钠致眠后睡眠潜伏期和睡眠持续时间;比较各组大鼠下丘脑5-HT和5-HIAA水平，下丘脑GABA蛋白表达。结果：中药观察组大鼠治疗后的行为学改善、自主活动数稳、戊巴比妥钠致眠后睡眠潜伏期和睡眠持续时间、下丘脑5-HT和5-HIAA水平、下丘脑GABA蛋白表达改善均优于艾司唑仑组大鼠及模型对照组大鼠，差异有统计学意义（ P <0.05）。结论：化瘀祛痰汤对失眠大鼠有良好的治疗作用，能够改善行为学和自主活动，延长睡眠潜伏期和睡眠持续时间，效果明显优于艾司唑仑。

关键词  化瘀祛痰汤;艾司唑仑;失眠;自主活动数;下丘脑5-HT;下丘脑5-HIAA;下丘脑GABA蛋白表达;治疗作用;机制

Exlporaiton of Therapeutic Effects and Mechanisms of Huatan Quyu Decoction on Insomnia Rats

WANG Qi1，LI Yan1，LI Yong2，WU Xian1

（1 The First Affiliated Hospital，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 The Second Affiliated Hospital，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract Objective： To observe the therapeutic effects of Huayu Qutan Decoction on insomnia rats and explore its mechanisms. Methods： A total of 40 adult SD rats were divided into a normal control group，a model control group，a traditional Chinese medicine treatment group and an estazolam group.The insomnia model was established in 3 groups except for the control group.Traditional Chinese medicine treatment group was given Huayu Qutan Decoction，estazolam group was given estazolam solution gavage，the model control group and the normal control group were given the same volume of distilled water gavage.The behavioral changes of rats in each group after modeling and treatment were observed; the number of autonomous activities of rats in each group before and after intervention were compared; the sleep latency and duration of sleep induced by pentobarbital sodium in each group after intervention were compared; and the content of 5-HT and 5-HIAA in hypothalamus and the expression of GABA protein in hypothalamus in each group were compared. Results： The improvement of behavior，number of autonomous activities，sleep latency and sleep duration induced by pentobarbital sodium，5-HT and 5-HIAA contents in hypothalamus，and GABA protein expression in hypothalamus in the traditonal Chinese medicine treatment group were better than those in the estazolam group and the model control group （  P <0.05 ）. Conclusion： Huayu Qutan Decoction has good therapeutic effects on insomnia rats.It can improve behavior and autonomic activity，prolong sleep latency and sleep duration.The effects are better than that of estazolam.It is speculated that it is related to the significant increase of 5-HT and 5-HIAA contents in hypothalamus and the promotion of GABA protein expression.

Keywords  Huayu Qutan Decoction; Estazolam; Insomnia; Autonomic activity number; 5-HT in hypothalamus; 5-HIAA in hypothalamus; GABA protein expression in hypothalamus; Therapeutic effects; Mechanism

中图分类号：R289.5;R256.23 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.008

失眠是临床常见病，是指入睡/睡眠维持困难、早醒、易醒并伴有日间功能障碍的一种睡眠障碍，对患者的日常生活和工作均可造成严重的影响[1]。失眠患者若得不到及時有效的治疗，可出现多种躯体或精神障碍疾病，对其身心造成二次打击，并且可加重患者的经济负担。艾司唑仑是失眠患者的常用药，但是效果不甚理想，往往难以彻底根除失眠，且长期应用容易出现依赖性，该药物的安全性也堪忧[2-3]。随着人们对中医理论的认识不断加深和中医治疗技术的推广应用，中医药在失眠患者中也得到了广泛的应用。中医学认为，失眠的根本病因在于痰蒙上窍、气滞血瘀，因而应以化痰祛瘀为治则[4]。李延教授特针对失眠患者拟定化痰祛瘀汤，并且在临床中已获得良好的效果，得到患者的一致认可。但是化痰祛瘀汤对失眠患者的作用机制尚有待深入探讨。本研究特实施大鼠实验，将化痰祛瘀汤与艾司唑仑在失眠大鼠中的治疗作用进行比较，并对其作用机制进行初步探讨，以为其在临床中的推广应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取40只成年SD大鼠，雌性各半，6～7周龄，体质量180～220 g，平均体质量（204.13±6.76）g，均购自黑龙江省实验动物研究中心，动物合格证编号：2017012。SPF级，适应性喂养1周，期间提供标准饲料，自有进水，25～27 ℃条件，30% ～50%湿度。

1.1.2 药物 丹参、川芎、红花、赤芍、桃仁、清半夏、瓜蒌、茯苓、陈皮、炙甘草均为黑龙江中医药大学附属第一医院采购，且均经鉴定符合国家药典标准。艾司唑仑（天津太平洋制药有限公司，国药准字H12020291）。

1.1.3 试剂与仪器 蒸馏水（佛山市普天宇信水处理设备有限公司，批号：3892）;弱碱性生理盐水[友康恒业生物科技（北京）有限公司，批号：A822];磷酸缓冲盐溶液（PBS）缓冲液（国药集团化学试剂有限公司，批号：3321D）;戊巴比妥钠（上海信裕生物科技有限公司，货号：283256）;5-HT（武汉博士德生物科技有限公司，批号：455723）;5-HIAA荧光分光光度法试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司，货号：AT3721）;兔抗鼠GABA单克隆抗体（美国Santa Cruz公司，货号：4819s）;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔GABA多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，货号：3835s）;匀浆机（苏州江东精密仪器有限公司，型号AD145S-P）;高速离心机（德国Eppendorf公司，型号：5084）;荧光分光光度计（杭州科晓化工仪器设备有限公司，型号：F96PRO）;化学发光荧光影像分析仪（上海捷钛仪器设备有限公司，型号：Fusion pluse7）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、中药观察组和艾司唑仑组。除正常对照组外，其余大鼠均建立失眠模型，方法：每日上午8：00腹腔注射PCPA混悬液1 mL/100 g，1次/d，连续注射2 d，正常对照组腹腔注射同体积的弱碱性生理盐水。建模成功的判断标准：于第1次腹腔注射24～28 h后，动物昼夜节律消失，白天也活动不停，表示建模成功。

1.2.2 给药方法 取丹参20 g、川芎15 g、红花15 g、赤芍15 g、桃仁15 g、清半夏15 g、瓜蒌15 g、茯苓15 g、陈皮15 g、炙甘草10 g，加8倍水，浸泡30 min后煎煮40 min，过滤药液;加6倍水再次煎煮40 min，过滤药液。将2次过滤的药液混合均匀，浓缩成药膏，采用蒸馏水配置为50%中药水煎液。中药观察组给予化瘀祛痰汤1 mL/kg灌胃（50%中药水煎液），艾司唑仑组给予同体积的1.3%艾司唑仑水溶液灌胃，模型对照组和正常对照组均给予同等体积的蒸馏水灌胃，1次/d，连续7 d。观察建模及治疗后行为学变化，统计各组大鼠干预前后自主活动数，注意实验需要在安静、通风、25～27 ℃条件下进行观察。

1.2.3 检测指标与方法 观察各组大鼠建模及治疗后行为学变化;2）比较各组大鼠干预前后自主活动数;3）比较各组大鼠干预后戊巴比妥钠致眠后睡眠潜伏期和睡眠持续时间;4）比较各组大鼠下丘脑5-羟色胺（5-HT）和5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）水平;5）比较各组大鼠下丘脑GABA蛋白表达。大鼠干预后戊巴比妥钠致眠后睡眠潜伏期和睡眠持续时间检测：于末次给药1 h后给予戊巴比妥钠腹腔注射，剂量为35 mg/kg（按照预实验测得的引起所有大鼠均睡眠的最小剂量计算），统计睡眠潜伏期和睡眠持续时间。大鼠下丘脑5-HT和5-HIAA水平检测：将所有大鼠均于末次给药并完成上述检测后采用断头法处死，迅速取下丘脑组织。将下丘脑组织剪碎并匀浆处理，按照1 500 r/min转速将匀浆液在台式离心机上离心分离处理，时间为10 min。吸取上层清液，加入含有1.5 mL磷酸缓冲盐缓冲液（0.1 mol/L）的离心管中，摇荡10 min。采用荧光分光光度法检测下丘脑5-HT和5-HIAA水平，注意严格按照试剂盒说明书操作。大鼠下丘脑组织GABA蛋白表达检测：取下丘脑组织，匀浆并对蛋白浓度进行定量检测。在100 ℃条件下水浴，10 min。采用10%浓度SDS-PAGE分离胶+4%浓度浓缩胶进行电泳，观察溴酚蓝变化，直至到达分离胶底部，可停止电泳。转膜并用脱脂奶粉封闭PVDF膜，室温，1.5 h。添加一抗，4 ℃孵育过夜;添加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h。洗脱10 min，加入ECL，室温避光孵育。采用化学发光荧光影像分析仪显影，并利用Quantity One软件检测下丘脑GABA蛋白表达量，其中内参为GAPDH。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（  ±s ）描述，多样本间差异以单因素方差分析，每2样本间差异以SNK-q检验。以 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠建模及治疗后行为学变化观察 所有大鼠建模及干预期间均无死亡。3建模组在PCPA注射12～48 h期间均有一定的兴奋性行为，白天明显躁动不安、活动增多，对外界光线和声音等刺激敏感性和攻击性均增强，大便灰白，小便正常。3建模组在PCPA注射72～96 h后大鼠经常低头、皮毛松乱、精神不振、进食和活动均减少，毛色暗淡，对外界刺激反应减弱，体质量增长缓慢甚至有部分大鼠体质量下降，疲劳状态严重。中药观察组和艾司唑仑组干预期间大鼠进食、活动、睡眠、毛色、体质量和对外界刺激反应均有所改善，而模型对照组部分大鼠状态无变化，另有部分大鼠状态更差。正常对照组大鼠建模及干预期间状态均正常。

2.2 各组大鼠干预前后自主活动数比较 各组干预前后自主活动数比较差异有统计学意义（ P <0.05），干预前正常对照组均高于其余3组（ P <0.05），且其余3组间每2组比较差异无统计学意义（ P >0.05）;干预后正常对照组自主活动数无变化，模型对照组减少，差异有统计学意义（ P <0.05），中药观察组和艾司唑仑组均增加，差异有统计学意义（ P <0.05），且干预后正常对照组自主活动数最多，中药观察组次之，艾司唑仑组更少，模型对照组更少，每2组间比较差异有统计学意义（ P <0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠干预后戊巴比妥钠致眠后睡眠潜伏期和睡眠持续时间比较 各组大鼠干预后戊巴比妥钠致眠后睡眠潜伏期和睡眠持续时间比较差异有统计学意义（ P <0.05），正常对照组最长，中药观察组次之，艾司唑仑组更短，模型对照组最短，每2组间比较差异有统计学意义（ P <0.05）。见表2。

2.4 各组大鼠下丘脑5-HT和5-HIAA水平比较   各组大鼠下丘脑5-HT和5-HIAA水平比较差异有统计学意义（ P <0.05），其中正常对照组最高，中药观察组次之，艾司唑仑组更低，模型对照组最低，每2组间比较，差异有统计学意义（ P <0.05）。见表3。

2.5 各组大鼠下丘脑GABA蛋白表达比较 各组大鼠下丘脑GABA蛋白表达比较差异有统计学意义（ P <0.05），正常对照组最高，中药观察组次之，艾司唑仑组更低，模型对照组最低，每2组间比较差异有统计学意义（ P <0.05）。见表4和图1。

3 讨论

失眠包括原发性和继发性2种，前者常见的病因有生理不适、心理打击、主观失眠等，后者主要包括躯体疾病，药物滥用和精神障碍等[5-6]。目前现代医学水平下人们对失眠的发生机制认识尚浅，临床治疗药物也缺乏特异性，难以获得良好的效果和预后[7-9]。随着中医学理论和技术的不断发展，中医药在失眠患者的治疗中逐渐显现出独特的优势。

本研究中结果显示，3建模组给予PCPA后均出现行为学改变，证明模型建立成功;中药观察组和艾司唑仑组治疗后行为学均出现不同程度的改善，证明化痰祛瘀汤和艾司唑仑对失眠大鼠模型均有良好的治疗效果，且中药观察组行为学改善效果最佳，表明化痰祛瘀汤的效果明显优于艾司唑仑。本研究自主活动数、戊巴比妥钠致眠后睡眠潜伏期和持续睡眠时间比较结果显示，化痰祛瘀汤的效果均最佳，艾司唑仑的效果均次之，可知化痰祛瘀汤对失眠大鼠的治疗作用明显优于艾司唑仑。艾司唑仑属于短效的苯二氮  艹  卓  类镇静、催眠药物，对失眠有一定的疗效，但是作用靶点单一，效果不甚理想且存在戒断反应[10-11]。中医学认为，失眠应当归属于“不寐”“不得眠”等范畴，现代中医学家认为该病的发生与瘀血内阻有关，主要病因有情志失调、病恙缠身、饮食不节、痰瘀气滞等，且痰瘀内阻是该病发生的根本原因[12-13]。化痰祛瘀汤是李延教授拟定的中药方剂，针对失眠患者“痰瘀内阻”的病机选用中药材，能够达到化痰理气、化瘀行气、活血安眠的作用。化瘀祛痰汤中医丹参为君药，既可活血祛瘀，又具安神宁心之效;配以川芎可活血祛瘀，并以桃仁、红花、赤芍相互为用，共同增强活血化瘀、行气逐瘀之效;另以清半夏消痞散结、化痰燥湿、宽中理气，以瓜蒌宽胸散结、清热涤痰，以茯苓李成渗湿利水、安神宁心;配合陈皮化痰祛湿、宽中理气。炙甘草则司调和之职，还可补脾和胃。诸药合用，可达活血化瘀、健脾益气、安神宁心、化痰安眠之效。现代研究证实，丹参中的丹参总苷有助于降低中枢神经系统的兴奋性，改善睡眠质量[14];茯苓中药饮片也能够改善失眠患者的睡眠质量[15]。由此可知，化痰祛瘀汤对失眠大鼠模型的治疗作用明显优于艾司唑仑，显示出良好的应用价值。

此外，本研究中还显示，中药观察组大鼠干预后下丘脑5-HT和5-HIAA水平与正常对照组最为接近，明显高于艾司唑仑组，且模型对照组均最低，提示化痰祛瘀汤能够改善失眠大鼠模型下丘脑中的神经递质水平。在干预后大鼠下丘脑GABA蛋白相对表达量的比较结果显示，中药观察组仅次于正常对照組，且明显高于艾司唑仑组，而模型对照组最低，可知化痰祛瘀汤能够上调失眠大鼠下丘脑GABA蛋白的表达，推测与改善大鼠失眠状况有关。5-HT在人体胃肠道组织、血小板和神经阻滞中广泛存在，能够参与心血管活动、睡眠-觉醒等多种生物学活动的调控，在众多5-HT受体亚型中能够参与不同的信号传导系统，发挥生物学效应。5-HIAA是5-HT的代谢产物，二者在失眠患者下丘脑组织中的水平均显著降低，与神经元的兴奋性有关[16-17]。GABA作为一种常见的抑制性神经递质，能够发挥抑制中枢神经系统兴奋性、抗惊厥、抗焦虑等生物学作用。该因子主要通过与相应的受体结合发挥生物学作用的，且其配体的表面均含有配体门控氯离子通道蛋白，借助与GABA的结合增加膜对氯离子的通透性，使氯离子内流，形成抑制性突触后电位，从而对中枢神经发挥抑制作用[18-19]。因此，在失眠大鼠和患者中均应用积极改善下丘脑5-HT和5-HIAA水平，上调GABA蛋白表达。郭晓等[20]报道，对失眠大鼠采用宁心安神方治疗既能够改善大鼠下丘脑5-HT和5-HIAA水平，还可增加下丘脑GABA蛋白的表达量，并且证实宁心安神方中的丹参、茯苓均能够发挥上述作用。结合上述分析和相关报道，可知化痰祛瘀汤中丹参和茯苓也能够改善下丘脑5-HT和5-HIAA水平，上调GABA蛋白表达，其余中药材是否能够调控上述因子仍需要进一步研究。由此可知，化痰祛瘀汤能够改善失眠大鼠模型下丘脑5-HT和5-HIAA水平，上调GABA蛋白表达。

综上所述，化痰祛瘀汤对失眠大鼠模型具有良好的治疗作用，且明显优于艾司唑仑，推测与改善下丘脑5-HT和5-HIAA水平，上调GABA蛋白表达有关，显示出良好的临床推广及应用价值。但是该方剂对失眠的具体作用机制仍需要深入探讨，需作为下一步的研究方向。

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（2019-03-22收稿 责任编辑：张雄杰）

基金项目：国家自然科学基金项目（81774426）;黑龙江省中医药科研项目（ZHY18-040）

作者简介：王琪（1982.11—），女，硕士研究生，主治医师，研究方向：心脑血管疾病，E-mail：liangzhiminglzm001@163.com

通信作者：吴限（1965.01—），女，研究生，主任医师，科室主任，研究方向：脑血管病，E-mail：ulicek@163.com