mTOR抑制剂PP242对高糖诱导足细胞损伤保护机制的实验研究

邵金金，刘新艳

糖尿病肾病是糖尿病的慢性微血管并发症之一，蛋白尿是糖尿病肾病的主要临床表现，若病情持续进展，最终发展为慢性肾衰竭。肾小球滤过屏障受损是蛋白尿产生的主要因素，而足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，足细胞结构和功能的完整性与蛋白尿的产生关系密切。高糖引起的足细胞损伤包括足细胞肥大、足细胞凋亡等。有研究表明，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂(如雷帕霉素)对高糖引起的足细胞损伤可能具有保护作用[1]。本研究观察高糖诱导的小鼠肾足细胞增殖与凋亡、裂孔隔膜分子Podocin表达的变化以及新一代mTOR抑制剂PP242的干预作用，探讨PP242对高糖诱导足细胞损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPMI1640培养基购自Hyclone公司，PP242 购自美国Cayman公司，小鼠γ-干扰素购于赛业生物，兔抗小鼠Podocin多克隆抗体、小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购于美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记二抗购于中杉金桥生物公司，胎牛血清购于四季青公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂购于碧云天生物技术公司。PP242用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，配制成100 mmol/L的储存液，过滤以后进行分装，分装好的PP242冻存。

1.2 足细胞培养及传代 小鼠肾足细胞购于北纳生物。足细胞首先培养于含10%胎牛血清、50 U/mL小鼠γ-干扰素的1640培养液中，置于33 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养，当细胞生长至70%～80%融合度时，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(含0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA)消化传代，然后转入不含γ-干扰素但含10%胎牛血清的1640培养液中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，诱导分化7～14 d后进行实验。

1.3 实验分组 将足细胞分为4组。正常组给予葡萄糖5.5 mmol/L；高糖组给予葡萄糖30 mmol/L；PP242干预1组给予葡萄糖30 mmol/L、1 μmol/L PP242； PP242干预2组给予葡萄糖30 mmol/L、10 μmol/L PP242。

1.4 MTT法检测足细胞增殖 取分化培养好的足细胞，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度，调至4×104/mL，然后接种在96孔培养板，每孔200 μL细胞悬液；放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，细胞贴壁生长呈亚融合状态后，更换为无血清的1640培养基，继续培养24 h，使细胞进入静止期G0期。按照分组情况，分别给予不同的干预，继续培养48 h；于培养结束前4 h，每孔加入MTT液(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h；弃掉细胞培养液，每孔加入DMSO 150 μL，于室温下振荡5 min，然后静置10 min。将酶标仪调至490 nm处，测定样本吸光度A值(OD490)。实验结果重复3次。

1.5 流式细胞仪检测足细胞凋亡 取分化培养好的足细胞，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度至3×105/mL，然后接种于6孔培养板，每孔2 mL细胞悬液。37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，细胞贴壁生长呈亚融合状态后，更换为无血清1640培养基，继续培养24 h，使细胞进入G0期。按照分组情况，给予不同的干预后，继续培养48 h。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤贴壁细胞1次，消化细胞，收集培养细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞并计数，取1×106重悬的细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，加入195 μL的细胞结合液，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 的碘化丙锭溶液，混匀后于室温避光孵育15 min。采用流式细胞仪分析。

1.6 Western Blot检测Podocin蛋白的表达 首先提取蛋白，培养并分组处理足细胞方法同1.5，收集标本。用预冷的PBS洗涤足细胞2次，加入细胞裂解液，然后冰上裂解30 min，4 ℃离心，15 000 r/min离心10 min，吸取上清液。用BCA法测定蛋白浓度。将变性后的蛋白样品加样，每孔30 μg，先电泳分离，后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室温下，以5%脱脂奶粉进行封闭，用1∶200稀释的Podocin多克隆抗体，1∶1 000稀释GAPDH单克隆抗体，4 ℃孵育，过夜。用辣根过氧化物酶标记的二抗，继续孵育1 h，ECL化学发光法进行显影、定影。用SAGECREATION凝胶成像系统成像，用Lane 1D分析软件对特异性条带进行灰度扫描，以Podocin蛋白条带与GAPDH蛋白条带的灰度比值表示Podocin蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 PP242对高糖培养的足细胞增殖的影响 细胞分组培养48 h后，高糖组足细胞增殖明显受到抑制，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组比较，PP242干预1组、PP242干预2组细胞增殖明显升高(P<0.05)，且随着PP242浓度的增大，作用更加明显，呈一定的剂量-效应关系。详见表1。

表1 各组足细胞增殖的吸光度值(OD490)比较(±s)

2.2 PP242对高糖培养的足细胞凋亡的影响 细胞分组培养48 h后，正常组足细胞凋亡率为(4.0±0.7)%，高糖组足细胞凋亡率为(18.8±0.6)%，高糖组足细胞凋亡率高于正常组(P<0.05)。高糖培养足细胞经PP242干预后，足细胞凋亡率较高糖组明显下降(P<0.05)，其中PP242干预1组足细胞凋亡率为(12.5±0.9)%，PP242干预2组足细胞凋亡率为(9.1±0.6)%，提示高浓度PP242干预后足细胞凋亡率更低。详见图1、图2。

图1 流式细胞仪检测足细胞凋亡情况

与正常组比较，*P<0.05；与高糖组比较，# P<0.05。

2.3 Western Blot检测Podocin蛋白表达的变化 高糖培养足细胞48 h后，高糖组足细胞Podocin蛋白表达下降，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)；高糖培养并经PP242干预后，PP242干预1组、PP242干预2组Podocin蛋白表达较高糖组明显上升(P<0.05)。详见图3。

A：正常组；B：高糖组；C：PP242干预1组；D：PP242干预2组。与正常组比较，*P<0.05；与高糖组比较，# P<0.05。

3 讨 论

目前认为，糖尿病肾病引起的足细胞损伤，主要包括足细胞肥大、足细胞凋亡、足细胞脱离以及足细胞向上皮间充质转分化[2]。而高糖引起足细胞损伤的机制可能为氧化应激损伤、微RNA、自噬以及外泌体等[3-4]。mTOR信号通路在信号转导、细胞自噬与细胞凋亡中起重要作用[5]。mTOR是自噬的负性调控因子，而mTOR特异性抑制剂(如雷帕霉素)与mTOR特异性结合后，可抑制mTOR的蛋白激酶活性，通过增加自噬来维持足细胞的自身稳态，抵御高糖的作用，减少细胞凋亡[6]。本研究旨在观察新一代mTOR抑制剂PP242对高糖引起的足细胞损伤有无保护作用。

本研究结果提示，高糖培养足细胞后，足细胞增殖明显减少，但同时加入PP242后，足细胞的细胞存活率较高糖组有所提高。高糖诱导足细胞后，足细胞凋亡增加，经PP242干预后，足细胞的凋亡率较高糖组降低。说明PP242可在一定程度上减弱高糖对足细胞增殖抑制的影响，PP242也可减少高糖引起的足细胞凋亡。PP242也是一种自噬诱导剂，对肿瘤坏死因子-α所致的肠屏障损伤、多囊肾大鼠胆管上皮细胞都有诱导自噬的作用[7-8]。

在对糖尿病肾病的研究中发现，足细胞的裂孔隔膜受损、足突发生融合以及足细胞从基底膜脱落，导致大量蛋白尿的产生。雷帕霉素具有减少实验动物蛋白尿的作用，可能与减少肾小球滤过屏障的通透性，上调Nephrin和Podocin蛋白的表达有关[9-10]。Nephrin、 Podocin与CD2AP 组成的复合体在维持裂孔隔膜结构的完整性上起到了重要作用[11]。Podocin是NPHS2基因产物，Podocin在介导裂孔隔膜与足细胞骨架连接方面发挥整合的作用。以往研究表明，糖尿病肾病鼠肾脏Nephrin和 Podocin蛋白表达下降。高糖刺激足细胞后，也可以引起足细胞出现Nephrin和 Podocin蛋白表达下降[10，12]，与本研究结果一致。PP242可以部分恢复Podocin蛋白表达，从而维护裂孔隔膜的完整性。因此，对于高糖引起的肾小球足细胞增殖、凋亡的影响以及Podocin蛋白表达的变化，PP242都有一定程度的干预作用，具有潜在的足细胞保护作用。