基于体外实验探讨补阳还五汤对血管新生的影响

庞晓丽，刘建卫，李虎虎，杨 琳，王青龙

血管新生是以内皮细胞增殖、迁移和成管为特征的复杂过程，常在营养和氧气供应不足时发生，且受多种促血管生成因子如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等调控，VEGF在血管新生中具有重要作用[1-2]。补阳还五汤为传统中药方剂，常被用于治疗脑血管疾病[3]。现代科学研究显示，补阳还五汤对脑缺血损伤的保护作用与促进血管新生有关[4-5]。然而该方剂对血管新生的影响及作用机制尚未完全阐明。因此，本研究以血管段、内皮细胞为研究对象，从体外实验探讨补阳还五汤对血管新生的影响，为补阳还五汤治疗缺血性损伤提供体外实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 补阳还五汤首载于《医林改错》，组方：黄芪120 g，当归6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g，地龙3 g。饮片购自北京同仁堂。鼠尾胶、MCDB131培养基、DMEM培养基、细胞计数8(CCK-8)、青霉素链霉素、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA、Trizol、Ⅰ型胶原和羧甲基纤维素等均购自Gibco(美国)公司；RNA反转试剂盒、Real-time PCR试剂盒购自北京天根生化技术有限公司。引物由Sangong生物技术公司(上海)合成。VEGF等抗体购自Santa Cruz生物技术公司(美国)。

1.2 实验动物和细胞 初断乳雄性SD 大鼠，体重约80 g，6周龄雄性SD大鼠，体重约 200 g，均购自中国医学科学院医学实验动物研究所[合格证号 SCXK(京)2014-0004]，经天津中医药大学动物管理和使用委员会批准。人脑微血管内皮细胞(HBMECs)购自美国Sciencell公司。

1.3 补阳还五汤载药血清制备 将雄性6周龄SD大鼠，按人和大鼠用药等效剂量换算(200 g大鼠对应70 kg成人的体表面积系数0.018，故200 g大鼠每天服用生药量为2.565 g)。课题组前期体内实验确定低、中、高剂量分别为等效剂量的0.5倍、1.0倍、2.0倍，故以此为基础分为补阳还五汤低、中、高剂量组，分别以低、中、高剂量进行灌胃，正常组则给予等体积生理盐水灌胃。各组每日灌胃1次，持续1周，于末次灌胃后2 h，腹主动脉无菌取血、分离血清，灭活后于-20 ℃保存备用。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 体外血管新生三维培养模型的构建 参照Zhu等[6]研究体外构建三维培养血管新生模型。7%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉初断乳SD 大鼠后，75%乙醇浸泡10 min，超净台内快速打开胸腔，剪开右心耳，以预冷的D-hank′s 液进行心脏灌流至流出液无色为止，切取约2 cm 胸主动脉，在预冷的D-hank′s 液中除去外膜，用手术刀切成1 mm 厚血管环，置于铺pH7.4鼠尾胶和MCDB131 混合培养基质的96 孔板内，37 ℃凝固20 min 后取出，在培养物上层再加入混合基质，37 ℃再次凝固20 min，于上层加入含10%胎牛血清的DMEM 培养液，培养72 h后。将培养的血管段分为对照组、补阳还五汤组(低剂量、中剂量、高剂量)，对照组加入10%空白鼠血清，补阳还五汤组加入10%不同剂量补阳还五汤载药血清，培养72 h后在倒置显微镜下观察血管新生情况。

1.4.2 细胞活力测定 将HBMECs(5 000个)培养3～5代后将其接种于96孔板中，继而将其分为对照组、模型组、模型+补阳还五汤组(低剂量、中剂量、高剂量)。对照组给予10%空白鼠血清；模型组参考王波等[7]研究方法，通过氯化钴(CoCl2)建立内皮细胞缺氧模型，并给予10%空白鼠血清；模型+补阳还五汤组给予10%不同剂量补阳还五汤载药血清。37 ℃培养箱培养24 h，采用CCK-8方法检测细胞活力。

1.4.3 划痕迁移试验 将HBMECs(1×105个)接种于24孔板中，同步化后用0.2 mL吸管尖端在培养板中间划“+”字，继而将其分为对照组、模型组(CoCl2致缺氧)、模型+补阳还五汤组。对照组和模型组均给予10%空白鼠血清，模型+补阳还五汤组则基于细胞活力测定实验，选择有统计学意义的10%补阳还五汤载药血清干预。采用倒置显微镜拍摄，通过测量划痕伤口边缘的相对距离来评估细胞迁移情况。

1.4.4 三维细胞培养 参照刘少坤等[8]研究方法，将HBMECs(1×106个)接种于非贴壁96孔板中培养，直至细胞形成多个球状体。将细胞小球与含体积分数10%新生小牛血清的Ⅰ型胶原(1.5 g/L)-甲基纤维素(1∶1)混合液中混匀后，移入24孔板中(每孔1 mL；每孔20～30个细胞球)并置于37 ℃、5%CO2的培养箱30 min。待混合物形成胶状结构后，每孔分别加入200 μL含有20 ng/mL的VEGF和/或不含10%补阳还五汤大鼠血清的培养基。继而将接种好的细胞球分为对照组和补阳还五汤组。对照组给予10%空白鼠血清，补阳还五汤组则基于细胞活力测定实验，选择有统计学意义的10%补阳还五汤载药血清干预。在倒置显微镜下观察内皮细胞的管状结构，并分别于24 h、48 h和72 h内在放大40倍情况下拍照。

1.4.5 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析 将HBMECs(2×106个)接种于6孔板中，将其分为对照组、模型组(CoCl2致缺氧)、模型+补阳还五汤组。对照组和模型组均给予10%空白鼠血清，模型+补阳还五汤组则基于细胞活力测定实验，选择有统计学意义的10%补阳还五汤载药血清干预。24 h后采用Trizol法提取补阳还五汤载药血清干预后的HBMECs细胞总RNA，继而采用RT试剂盒反转成cDNA。基于设计好的引物(VEGF，5′-3′端GCTACTGCCATCCAATCGAG，3′-5′端TGCATTCACATTTGTTGTGC)根据PCR说明书，以25 μL作为反应体系进行检测，以双Δ法计算VEGFmRNA相对表达变化。

2 结 果

2.1 主动脉血管段新生血管情况 各组均有不同程度的血管新生，补阳还五汤各剂量组新生血管数量较对照组增加，尤以高剂量组最为明显。详见图1。

图1 各组主动脉血管段新生血管情况(光镜，×100)

2.2 HBMECs增殖情况 采用CoCl2建立内皮细胞缺氧模型。如图2所示，以250 μmol/L CoCl2对内皮细胞损伤开始出现统计学意义，故本研究采用此浓度构建内皮细胞缺氧模型，造模后给予补阳还五汤载药血清干预。结果显示补阳还五汤干预后细胞活力明显增强，且与剂量呈正相关(见图3)。因此，后续实验均采用高剂量载药血清进行干预。

与0 μmol/L比较，*P<0.05，ΔP<0.01。

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。

2.3 HBMECs迁移情况 在血管新生过程中，内皮细胞迁移是必不可少的过程。本研究通过划痕实验评价补阳还五汤对内皮细胞迁移的影响，基于内皮细胞增殖实验，划痕实验中补阳还五汤组选择高剂量组作为药物干预组；对照组为正常条件下培养0～10 h，模型组和补阳还五汤组采用CoCl2(250 μmol/L)进行化学缺氧造模，继而在不同浓度载药血清(0和10%)条件下孵育0～10 h。结果显示补阳还五汤能有效促进内皮细胞迁移。详见图4。

图4 各组内皮细胞迁移情况(光镜，×100)

2.4 内皮细胞成管情况 基于三维培养以图5A中血管计数方法为标准，统计血管数量。结果显示补阳还五汤载药血清干预后，与对照组比较管腔数量明显增加；在维持时间上，对照组在72 h管腔开始退化，而补阳还五汤组管腔结构正常(见图5B)。详见图5。

图5 各组对内皮细胞成管的影响(光镜，×40)

2.5 VEGF mRNA表达情况 RT-PCR结果显示，与模型组相比，补阳还五汤组可以促进VEGF表达(P<0.01)。详见图6。

与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，# P<0.01。图6 各组VEGF mRNA表达比较

3 讨 论

血管新生对于缺血性组织损伤性疾病的恢复，如缺血性脑卒中、心肌梗死等至关重要[1]。新生血管不仅可以为组织提供氧气，还可以恢复细胞代谢，进而改善组织功能。补阳还五汤为治疗脑卒中之名方，该方由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁组成，活血而不伤正，能使亏损之气得以补还，因虚致瘀之血得以运行，共奏补气活血通络之效，对心脑血管疾病疗效确切[9]。现代医学研究证明补阳还五汤对脑缺血损伤的保护作用与促进血管新生有关[10-11]。

为进一步阐明补阳还五汤对血管新生的影响，本研究首先构建血管段三维培养模型，判断补阳还五汤对血管新生的作用。结果表明，补阳还五汤能促进主动脉环的血管新生反应，说明该方剂对血管新生有影响。如前所述，血管新生常在缺血缺氧情况下发生，是一个从已有血管中建立新血管的复杂过程，主要包括内皮细胞增殖、迁移、出芽形成新的血管网等步骤[1-2]。故本研究以内皮细胞为研究对象，进一步探讨补阳还五汤对血管新生的影响。结果显示，补阳还五汤可明显促进内皮细胞增殖、迁移和成管。

众所周知，内皮细胞增殖、迁移和成管受一系列血管生长因子调控[1]。其中VEGF作为最具代表的血管新生调控因子之一[2，12]，可与内皮细胞表面受体VEGF受体2(VEGFR 2)结合激活酪氨酸激酶，进而启动一系列事件，包括磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和RAF/MEK/ERK信号通路，最终刺激内皮细胞增殖、迁移和成管[13-14]。研究显示通过阻断VEGF受体或抑制VEGF的产生可明显减少血管新生[15]。本研究结果显示，补阳还五汤能促进内皮细胞VEGF表达。因此，推测补阳还五汤对血管新生的作用与促VEGF表达有关。

总之，本研究从体外角度探讨补阳还五汤对血管新生的影响。虽然阐明该方剂促血管新生与调控VEGF有关，但具体信号通路还需进一步研究。