来氟米特通过调节miR-449a 在肺纤维化中的机制研究

刘 冬，赖伟男 （. 陆军军医大学新桥医院药剂科，重庆 400037；. 南方医科大学南方医院风湿免疫科，广东 广州

510515）

成纤维细胞的增殖和活化引起的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的累积是肺纤维化的主要病理基础[1]。肺纤维化治疗难度大，且发展到晚期纤维化过程不可逆转，而一些药物的长期使用会提高肺纤维化的发生风险，对于这临床的一类并发症应格外重视。来氟米特（leflunomide，LEF）是治疗类风湿性关节炎的常用药物，但是有临床报道称，长期服用LEF 可能提高肺纤维化的发生风险，但是也有研究认为LEF 对肺纤维化影响不大[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）长度约为18～22 个核苷酸，虽然不具备编码功能，但是可通过识别和碱基配对的方式与靶基因信使RNA（message RNA，mRNA）的3'非翻译区（3'UTR）结合，从而参与基因表达的调控[3]。miR-449a 具有抑制肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡的作用[4]，并且最新研究发现miR-449a 可能与肺纤维化有关，在二氧化硅诱导的肺纤维化模型中，miR-449a 可通过调节自噬缓解纤维化[5]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是调节细胞增殖、凋亡和分化的重要蛋白，其磷酸化后可通过信号转导调控细胞生物学行为[6]。本文发现了miR-449a 的过表达会显著缓解由LEF 引起的肺成纤维细胞的增殖，而沉默miR-449a 对细胞的影响相反，这可能是LEF 引起肺纤维化的机制之一，报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人肺成纤维细胞MRC-5 购自美国ATCC；LEF（苏州长征-欣凯制药有限公司，国药准字H20000550）；RPMI-1640 培养基以及血清购自美国Gibco 公司；miR-449a mimic 和inhibitor 质粒由Genepharma 公司构建；

LipofectamineTM2000（美国Invitrogen 公司）；荧光显微镜（Olympus BX51）；Model 680 酶标仪（Bio-Rad，美国）；流式细胞仪（BD FACScanto II，Becton Dickinson，美国）。CCK-8 试剂盒（武汉华美公司）；凋亡试剂盒（美国Thermo Fisher）；PVDF 膜（美国Bio-Rad 公司）；抗体购自美国Abcam 公司，逆转录试剂盒TaKaRa 和SYBR Prellix Ex TaqTM 实时PCR 试剂盒购自TaKaRa（日本）。

1.2 细胞分组和转染

MRC-5 细胞在RPMI-1640 培养基中培养，温度为37 ℃，CO2浓度为5%。细胞被分为6 组，即对照组、LEF 组、LEF+mimic 组、mimic 组、LEF+inhibitor 组和inhibitor 组。其中LEF+mimic 组和mimic 组 通 过 转 染miR-449a mimic 质 粒 过 表 达miR-449a 的水平，LEF+inhibitor 组和inhibitor 组通过转染miR-449a inhibitor 质粒使miR-449a 的水平降低。对照组转染空载质粒。LEF 组、LEF+mimic组和LEF+inhibitor 组分别在5 mg/L LEF 的条件下培养48 h。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 qPCR 检测miR-449a

将细胞裂解后收集总RNA 并检测纯度，通过逆转录试剂盒合成cDNA，然后进行PCR 反应，步骤如下：95 ℃下2 min，95 ℃下15 s，60 ℃下25 s和72 ℃下60 s，共进行40 个循环。以U6 作为内参，使用2-ΔΔCT法分析miR-449a 水平。引物序列如下（5′-3′），miR-449a 上游引物：TGCGGTGGCAGTGTATTGTTAGC，下游引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT；U6 上游引物：GGGCAGGAAGAGGGCCTAT，下游引物：TATGGCTAGCATGACTGGT。

1.3.2 CCK-8 法检测细胞活力

将细胞调节至2×104个细胞/ml 的密度，接种于96 孔板中，100 μl/孔。再培养24、48 和72 h 后将10 μl 的CCK-8 试剂加入至每孔中，37 ℃下培养2 h。在酶标仪上测量450 nm 处的吸光度（A），计算相对细胞活力。

1.3.3 克隆形成检测细胞增殖能力

分别将各组细胞200 个细胞在6 孔板中培养，每3 天补充一次培养基，培养2 周。用PBS 洗涤细胞并加入甲醇固定15 min，加入使用结晶紫染色30 min，在显微镜下观察克隆形成的数目，≥50 个细胞的集落为一个克隆形成。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡

将细胞洗涤后重悬于结合缓冲液中，使细胞浓度为2.5×105个/ml。根据试剂盒说明书将试剂加入细胞中，并通过流式细胞术分析细胞凋亡情况。

1.3.5 免疫荧光染色

通过免疫荧光染色检测α 平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）和胶质蛋白I（collagen I，Col I）的表达情况分析细胞的表型和细胞外基质。然后将细胞在4 ℃下使用α-SMA 的抗体染色过夜，用异硫氰酸四甲基罗丹明的山羊抗兔抗体染色30 min。然后再于避光条件下利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对细胞核染色10 min，通过荧光显微镜观察。

1.3.6 Western blot 检测蛋白表达

通过Western blot 检测JNK 和磷酸化JNK（p-JNK）蛋白的水平。将细胞裂解、离心收集总蛋白并检测蛋白浓度。使用10%的SDS-PAGE 凝胶用于电泳分离蛋白，电泳后使用PVDF 膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。分别加入一抗（稀释1:1 000）室温震荡2 h，后在4 ℃孵育过夜，加入二抗（稀释1:5 000），孵育3 h。通过Quantity One软件分析条带的灰度值并以GAPDH 为参照计算目标蛋白质的表达量。

1.4 统计学处理

实验数据采用SPSS 19 软件进行处理，实验结果以平均值±标准偏差（SD）表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，统计学显著性表示为P＜0.05。

2 结果

2.1 各组细胞miR-449a 表达水平

使用qPCR 检测各组细胞中miR-449a 表达水平。结果显示mimic 组miR-449a 水平显著高于对照组，inhibitor 组的miR-449a 表达水平显著低于对照组（P＜0.05），说明转染实验成功。LEF 组的miR-449a 水平显著低于对照组（P＜0.05），并且LEF+mimic组的miR-449a 的表达水平显著高于LEF 组，LEF+inhibitor 组的miR-449a 显著低于LEF 组（P＜0.05）。表明LEF 可抑制人成纤维细胞中miR-449a 的表达，见表1。

表1 各组miR-449a 表达水平比较

2.2 各组细胞的细胞活力比较

使用CCK-8 法检测各组细胞的相对细胞活力。结果显示在第48 小时和第72 小时，LEF 组和inhibitor 组的细胞活力显著高于对照组（P＜0.05），而mimic 组的细胞活力显著低于对照组（P＜0.05）。此外，LEF+mimic 组的细胞活力显著低于LEF 组，LEF+inhibitor 组的细胞活力显著高于LEF 组（P＜0.05），过表达miR-449a 可部分逆转LEF 对促进人成纤维细胞的细胞活力的作用，而降低miR-449a 的水平会进一步促进细胞活力，见表2。

表2 各组细胞的相对细胞活力比较（%）

2.3 各组细胞增殖和凋亡情况比较

LEF 组和inhibitor 组的克隆形成数目显著高于对照组而细胞凋亡率低于对照组（P＜0.05），mimic 组的克隆形成数目显著低于对照组而细胞凋亡率显著高于对照组（P＜0.05）。此外，LEF+mimic组的克隆形成数目显著低于LEF 组而细胞凋亡率显著高于LEF 组（P＜0.05），LEF+inhibitor 组的克隆形成数目在LEF 的基础上进一步升高而细胞凋亡率进一步降低（P＜0.05）。过表达miR-449a 可逆转LEF 促进肺成纤维细胞增殖和抑制凋亡的作用，而低表达miR-449a 会加剧LEF 的作用，见表3。

表3 各组细胞增殖和凋亡情况比较

2.4 各组细胞中α-SMA 和Col I 水平比较

本次研究通过免疫荧光技术检测了各组α-SMA 的水平来分析细胞向肌细胞转化情况，检测Col I 的水平来分析ECM 水平。其中蓝色荧光为细胞核，红色荧光为α-SMA 或Col I 蛋白。LEF 组和inhibitor 组的荧光强度显著高于对照组（P＜0.05），而mimic 组的相对荧光强度低于对照组（P＜0.05）。此外，LEF+mimic 组的相对荧光强度显著低于LEF 组（P＜0.05），LEF+inhibitor 组的相对荧光强度显著高于LEF 组（P＜0.05）。过表达miR-449a 可部分逆转LEF 对促进人成纤维细胞α-SMA 和Col I 表达的促进作用，见图1、图2 和表4。

2.5 各组p-JNK/JNK 水平比较

LEF 组和inhibitor 组的p-JNK/JNK 水平高于对照组，mimic 组的p-JNK/JNK 水平显著低于对照组（P＜0.05），并且LEF+mimic 组中p-JNK/JNK 水平显著低于LEF 组（P＜0.05），LEF+inhibitor 组中p-JNK/JNK 水平显著高于LEF 组（P＜0.05）。过表达miR-449a 可逆转LEF 促进JNK 蛋白磷酸化的作用，见表5。

3 讨论

肺纤维化是一种慢性进行性肺部疾病，但是临床上尚无治疗肺纤维化的特效方法和药物，目前用于进行性肺纤维化的唯一有效治疗方法是肺移植[7]，若患者未接受肺移植，通常在诊断后的3 至5 年内出现肺功能丧失导致呼吸衰竭和死亡。肺纤维化的病理特征包括纤维增生和ECM 沉积过多，但是这个过程较为漫长，并且在早期症状不明显，也缺乏相应的诊断手段，在患者确诊为肺纤维化时再采取治疗效果有限。因此虽然LEF 是否会引起肺纤维化尚无定论，但是由于肺纤维化的恶性预后和致死率，LEF 治疗过程中的肺纤维化风险仍是临床重点关注的问题。研究LEF 促进肺纤维化的机制是寻找诊断和治疗肺纤维化新方法的重要途径。

表4 各组细胞α-SMA 相对荧光强度比较

表5 各组p-JNK/JNK 相对水平比较

LEF 是一种调节免疫的药物，其作用机制通过抑制二氢乳清酸脱氢酶来抑制T 淋巴细胞和其他类型细胞的细胞周期进程[8]。LEF 引起的肺纤维化并导致患者死亡的病例随着LEF 使用时间的增加而升高[9]。一项长期的调查随访报告指出，在5911 例使用LEF 治疗的患者中，共出现了80 例间质性肺病，其中有27 例患者死亡，并且结果判定其中有18 例患者的死亡是由于LEF 直接导致[10-11]。在肺纤维化的过程中，成纤维细胞向成肌纤维细胞转化和ECM 的累积是两大特点[12]。因此本文主要分析了LEF 对人肺成纤维细胞的影响，结果显示LEF 可显著促进成纤维细胞的细胞活力和增殖，抑制其凋亡，并诱导细胞表达大量的α-SMA 蛋白和ECM 累积。α-SMA 是上皮细胞向间质细胞转化的检测指标之一，也是体外研究肺纤维化的最常用指标，而Col I 是ECM 的主要成分[13]。作者提示了LEF 可通过活化成纤维细胞和促进其增殖参与肺纤维化。

为进一步分析LEF 调节肺成纤维细胞增殖和表达α-SMA 的机制，我们检测了miR-449a 在其中的作用。miR-449a 是近年来新发现的一种miRNA，研究已经证实了其可通过靶向并诱导靶基因mRNA 降解，抑制肺癌细胞的增殖、上皮间充质转化[14-15]。本次研究结果显示LEF 可抑制miR-449a 的表达水平，并且过表达miR-449a 可抑制成纤维细胞的细胞活力、细胞增殖能力，抑制α-SMA 和Col I 蛋白的表达，并促进其凋亡。过表达miR-449a 会逆转由LEF 引起的细胞活化、增殖以及α-SMA 和Col I 蛋白的表达，而抑制miR-449a的水平会进一步加剧LEF 的促纤维化作用。Zhang等[16]的研究结果也显示miR-449a 具有调节α-SMA 蛋白表达的作用。通过进一步的研究我们还发现LEF 可促进JNK 的磷酸化，过表达miR-449a 会抑制JNK 磷酸化水平并显著逆转LEF 促进JNK 磷酸化的作用。JNK 的活化在促进肺癌发生和发展中的作用已经被广泛证实，此外，JNK 可活化可能通过活化肝星状细胞引起肝纤维化[17]。Yang 等[18]的研究结果显示阻断JNK 途径可抑制成纤维细胞样滑膜细胞的活性，并抑制迁移和侵袭。Shingyochi 等[19]的研究结果也显示了激活JNK 通路会促进成纤维细胞的增殖和迁移。这提示LEF 可能通过miR-499a 促进JNK 蛋白的磷酸化，从而促进肺成纤维细胞的活化和增殖，并促进细胞向肌纤维细胞转化和ECM 的累积，进而引起肺纤维化。

综上所述，LEF 可能通过抑制肺成纤维细胞中miR-449a 的表达激活JNK 途径，促进α-SMA的表达和ECM 的累积，从而诱导成纤维细胞的活化和增殖，抑制其凋亡，从而引起肺纤维化。但是，关于LEF 调节miR-449a 的机制和miR-449a 在JNK 途径中的作用仍需要进一步的研究。