屏南龙源‘四季杜鹃’古树组培快繁技术研究

胡计红 陈桂信 杨惠婷 康建坂 甘代奎

摘  要：以屏南縣棠口乡龙源村400多年‘四季杜鹃古树的顶芽为外植体，开展离体快繁技术研究，探讨外植体消毒方式、取材时间对无菌系建立的影响，培养基中植物生长调节剂种类和配比对芽苗继代增殖的影响，以及培养基中植物生长调节剂的种类与配比对无根苗瓶内生根的影响。试验结果表明，外植体表面消毒以75%酒精作用30 s后再用0.1% HgCl2消毒8 min，消毒效果最好。外植体最佳的取材时间为5月中旬前后。在无菌系建立中污染的外植体可采用75%酒精消毒20 s，然后用0.1% HgCl2消毒5 min，再经4次转瓶后成功率可达71%。初代培养的最适培养基为WPM+3.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3 ，平均有效芽数为3.45。在增殖培养中，带腋芽茎段诱导丛生芽的增殖效果优于顶芽，最适培养基组合为Anderson+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA，增殖系数达13.23。最适的瓶内生根培养基为：WPM+0.1 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA，生根率达92.6%。本研究的结果可为‘四季杜鹃古树的保护与开发利用提供理论与技术支持。

关键词：屏南四季杜鹃;古树;离体快繁

中图分类号：Q813.1      文献标识码：A

Abstract： Rapid propagation in vitro was explored using the apical buds of an ancient Four-season Rhododendron tree， more than 400 years， from Longyuan Village， Tangkou Town， Pingnan County as the explants to find the effects of sterilizing methods and time of explants on the development of sterile cultures， effects of kinds and ratios of plant growth regulators added in the media on the proliferation of shoots and rooting of rootless shoots. The optimum sterilization conditions were the explants treated with 75% of ethanol for 30 seconds and then dipped with 0.1% of HgCl2 for 8 minutes. The optimum sampling period for explants was about middle to late May. After four times of bottle transfer success rate of re-sterilizing reached 71% through rescuing of the contaminated explants in the development of sterile cultures by treating with 75% of ethanol for 20 seconds and then dipping with 0.1% of HgCl2 for 5 minutes. The optimum components of the medium in the primary culture was WPM medium added 3.0 mg/L of zeatin （ZT）， 0.1 mg/L of NAA and 0.5 mg/L of GA3， on which the average number of induced valid buds was 3.45. In the proliferation culture， the clustered shoots were induced from apical and stem segments with axillary buds of sterile plant-lets inoculated on Anderson medium added 0.5 mg/L of TDZ and 0.1 mg/L of NAA， multiplication coefficient of stem segments with axillary buds was higher than that of apical buds， reached 13.23. In the rooting culture of rootless shoots， the optimum medium was WPM medium added 0.1 mg/L of ZT and 0.5 mg/L of NAA， on which the rooting rate reached 92.6%. The results would provide theoretical and technical supports for conservation， exploitation and utilization of the ancient Four-season Rhododendron tree.

Keywords： Pingnan Four-season Rhododendron; ancient tree; rapid propagation in vitro

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.017

杜鹃花是杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron）著名观赏植物[1]。福建‘四季杜鹃观赏价值很高，但大多处于山间野生状态，很少人工栽培，甚至有些稀有类型仅单株保存延续种性。屏南县地处闽东的宁德市高海拔山区，分布着丰富多样的‘四季杜鹃种质资源，在棠口乡龙源村村口有1株开红花的杜鹃花古树，经鉴定该树属锦绣杜鹃（Rhododendron pulchrum Sweet）变种，树龄400 a以上，该树四季开花，成为屏南县独有的、有开发利用价值的珍稀地方种质资源。

屏南县龙源村的‘四季杜鹃古树具有一般高山杜鹃特性：枝粗叶少、无种子、生长周期长、通常靠扦插繁殖[2]。但随着树木的成熟，插穗形成不定根的能力逐渐下降[3]，且古树生理年龄大，芽的分生能力弱，扦插成活率低，对母树的伤害和受繁殖季节影响大，很难实现对古树的保护利用。组培快繁具有所需繁殖材料少、繁殖系数高、种苗基因型和长势整齐一致、不受季节影响等优点[4]，被广泛应用于杜鹃花的繁殖与工厂化生产。1975年Anderosn[5]以高山杜鹃的茎尖为外植体，进行组织培养研究，成功获得再生植株;在此基础上，汤桂钧等[6]探讨了基本培养基种类对高山杜鹃继代增殖的影响;王吉等[7]、刘玉东等[8]筛选了高山杜鹃继代增殖培养基中植物生长调节剂种类和浓度配比的最佳组合。

‘四季杜鹃古树树龄长，生命力和再生能力较弱，植株表面和体内寄生了多种病原菌（图1C），给组培快繁增加了难度;20世纪80年代初期，屏南县政府邀请了中科院上海植生所的研究人员，曾对该杜鹃花古树进行组培快繁试验，未获得成功;1986年，福建农学院陈振光等[9]对传统杜鹃组培技术进行改进，在MS基本培养基中，添加高强度的细胞分裂素6-（Hydroxy-3-methy?lbut-2-enylamino）purin （ZT）和6-（γ，γ-Dimethylall?ylamino）purine （2iP）和1-Naphthylacetic acid （NAA），成功诱导再生植株，并移栽成活，组培苗成年后，表现花期长，除了盛夏不开花，其余时间鲜花不断;该研究未公布培养基的植物生长调节剂的配比，无法给后续的研究提供借鉴。

本研究以屏南县的‘四季杜鹃古树的顶芽为材料，参考前人的杜鹃组培快繁技术，改进无菌系建立的方法，减少污染率，提高成活率;优化初代培养、继代增殖和生根培养的基本培养基种类和植物生长调节剂的种类与配比，建立‘四季杜鹃古树的组培快繁体系，为今后‘四季杜鹃古树的保护、繁育和开发利用提供理论与技术支撑。

1  材料与方法

1.1  材料

茎段外植体分别于2018年10月中旬、2019年3（图1A）、5（图1B）、6月份中旬采自福建省宁德市屏南县棠口乡龙源村的‘四季杜鹃古树当年生中上部新枝。

1.2  方法

1.2.1  无菌系建立  对10月中旬取材的龙源‘四季杜鹃古树单芽嫩枝进行消毒处理。除去叶片，留有叶柄的带顶芽茎段在流水下用软毛刷轻轻刷洗表面，5% 雕牌洗衣粉溶液洗涤浸泡25 min，蒸馏水冲洗20 min，50 %多菌灵浸泡30 min，蒸馏水冲洗3次，然后转至超净工作台，无菌水冲洗3次，75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，然后采用0.1% HgCl2做不同的消毒时间处理，最后用无菌水洗5次以上;用滤纸吸干材料表面水分，将材料剪成带顶芽茎段，接入WPM+蔗糖30 g/L+琼脂6.7 g/L，pH 5.0～5.4培养基中。10 d后，统计其污染数，30 d后观察外植体生长情况，对污染率、死亡率、成活率进行统计。次年3、5、6月份中旬取材的‘四季杜鹃古树嫩枝做同上处理，0.1% HgCl2消毒采用8 min。培养条件均为：温度（25±2） ℃，光照强度1500～2000 Lux，光照时间12 h/d。

1.2.2  无菌系建立中污染的外植体再消毒利用  将污染的外植体取出，用软毛刷清洗、蒸馏水冲刷后，分别以5个消毒处理（酒精30 s、次氯酸钠15 min、酒精20 s+次氯酸钠5 min、酒精20 s+ HgCl2 5 min、酒精30 s+ HgCl2 5 min）进行灭菌。后接入WPM培养基中，每个处理15瓶，3次重复;接种10 d后观察污染情况，30 d后观察外植体生长情况进行数据统计。

1.2.3  诱导培养  将未污染且成活的外植体，接种于以WPM和1/4MS为基本培養基添加了（3.0、5.0） mg/L ZT和0.1 mg/L NAA组合的初代培养基上，诱导腋芽萌发。每个处理接种15瓶，每瓶接种1个外植体，3次重复;接种后40 d统计高度大于2 cm的有效芽诱导数（1/4 MS培养基中附加蔗糖30 g/L，琼脂6.7 g/L，pH 5.0～5.4）。

1.2.4  继代增殖培养  将经诱导培养的无菌苗顶芽与带腋芽茎段分别接种于以WPM和Anderson为基本培养基并附加（0.5、1.0）mg/L ZT和0.1 mg/L NAA或（0.5、1.0） mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA组合的不同增殖培养基中，每个处理接种5瓶，每瓶接种3个外植体，3次重复;接种后60 d统计分析，筛选出杜鹃增殖培养过程中最佳培养基组合（Anderson培养基中附加蔗糖30 g/L，琼脂7.2 g/L，pH 5.0～5.4）。

1.2.5  瓶内生根培养  选取增殖培养后长势一致的无根苗，剪成长2～3 cm左右的带顶芽茎段，分别接种于添加了（0.5、1.0）mg/L NAA或（0.5、1.0）mg/L IBA或0.1mg/L ZT与（0.5、1.0）mg/L NAA组合的WPM生根培养基中，每个处理接种10瓶，每瓶接种2个外植体，3次重复;接种后60 d观察统计无根苗的生根情况计算生根率。

1.3  数据处理

采用Excel整理实验数据，SPSS 22.0进行差异显著性分析。

2  结果与分析

2.1  HgCl2消毒时间对无菌系建立的影响

10月初取材，不同时间消毒处理结果不同。如表1所示，随着HgCl2消毒时间的增加，3号处理与各处理相互间平均污染率具有显著性差异，但5号处理平均污染率最低，为31.3%;平均死亡率在1和3号处理上无显著性差异，其他处理间差异性显著;1号处理平均死亡率最低，为14.9;平均成功率在1和2号处理间差异不显著，4号处理平均成功率显著高于其他处理，为44.3%，5号处理平均污染率虽然最低，但消毒时间较长，0.1% HgCl2对顶芽产生毒害，成功率低。所以，‘四季杜鹃古树当选用顶芽作为外植体时，0.1% HgCl2最佳的表面消毒时间为8 min。

2.2  取材时间对无菌系建立的影响

10月初与3、5、6月份中旬分别采‘四季杜鹃古树带顶芽的茎段，如表2所示，经消毒处理后，不同月份取材对无菌体系建立阶段平均污染率、平均死亡率、平均成功率均存在显著性差异（P<0.05）;3号处理，平均污染率和死亡率最低，分别是22.5%和10.8%，平均成功率最高，为66.7%;所以，5月中旬为外植体最佳取材时间。

2.3  污染的外植体再消毒对无菌系建立的影响

对无菌系建立阶段外植体仅基部长菌污染的，进行再消毒和4次转瓶处理。如表3所示，消毒方式不同平均污染率在1、3与2、4、5号处理间具有显著性差异，1号处理最高，达79.5%;平均死亡率均具有显著性差异，其中 2号处理死亡率较高，为84.8%;1、2、3号处理的成功率为0，4号处理平均成功率达到71%，且与其他处理差异性显著。因此，酒精20 s+0.1% HgCl2 5 min为外植体污染再消毒的最佳方式。

2.4  基本培养基种类与植物生长调节剂配比对初代培养的影响

在诱导不定芽的过程中，接种的外植体整体在第7～10 d不定芽萌发（图2A），20 d后不定芽伸长，生长速度较快（图2B），30 d后不定芽伸长至2.0～2.5 cm，叶片下垂（图2C），第40 后不定芽生长速度缓慢（图2D）。如表4所示：3号处理诱导的平均有效芽数最多，为3.45，且生长状况相对较好;1/4 MS为基本培养基时，平均芽数为3.36，与WPM培养基中芽数相近，但1/4 MS诱导的不定芽细长卷曲状，状态差;综合以上，在初代培养中，‘四季杜鹃古树最佳培养基为：WPM+3.0 g/L ZT+0.1 mg/L NAA。

2.5  基本培养基与植物生长调节剂对无菌苗顶芽继代增殖的影响

在无菌苗顶芽诱导不定芽过程中，添加ZT培养基组合7～10 d顶芽伸长不定芽萌发，30 d不定芽伸长至2 cm左右，60 d后生长缓慢，叶片逐渐下垂变褐，均无愈伤组织形成;在添加TDZ培养基组合中，7～10 d不定芽萌发，基部有愈傷组织形成，30 d不定芽长势良好，基部愈伤组织不定芽萌发（图3A）;60 d（图3B）不定芽伸长至1.0～2.5 cm，生长缓慢;如表5，在WPM培养基中添加ZT或TDZ时，随着ZT或TDZ浓度的提高，平均芽诱导率差异不明显或无差异（P< 0.05），芽的增殖系数随着其浓度的提高均达到显著性差异;在Anderson培养基中，随着ZT浓度的提高，平均芽诱导率和增殖系数随着其浓度的提高均达到显著性差异，随着TDZ浓度的提高，平均芽诱导率无差异，芽的增殖系数随着其浓度的提高达到显著性差异;7号处理的芽诱导率100%，芽增殖系数为9.31，显著高于其他培养基组合;因此，顶芽诱导不定芽的最适培养基组合为Anderson+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

2.6  基本培养基与植物生长调节剂对无菌苗带腋芽茎段继代增殖的影响

带腋芽茎段在添加ZT的培养基组合中无愈伤组织形成，7～10 d不定芽从基部或叶腋处萌发，30 d后不定芽增殖状态稳定，60 d后不定芽生长缓慢，均高2.5 cm左右;在添加TDZ的培养基组合中，10～20 d茎段基部或叶腋处不定芽萌发，基部有愈伤组织形成，30 d不定芽伸长0.1～0.5 cm左右，愈伤组织上不定芽萌发（图3C），60 d后不定芽呈簇生状，生长缓慢（图3D）;如表6，在WPM培养基中添加ZT或TDZ时，随着ZT或TDZ浓度的提高，平均芽诱导率均为100%，无显著差异（P<0.05），芽的增殖系数随着其浓度的提高均达到显著性差异;在Anderson培养基中，随着ZT浓度的提高，平均芽诱导率和增殖系数随着其浓度的提高均达到显著性差异，随着TDZ浓度的提高，平均芽诱导率无差异，芽的增殖系数随着其浓度的提高达到显著性差异;7号的增殖系数最高，为13.23;因此，带腋芽茎段诱导不定芽的最佳培养基组合为Anderson+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

2.7  植物生长调节剂种类与配比对无根苗瓶内生根的影响

观察发现，在添加了生长素NAA或IBA的培养基中，60 d后不定根萌发，90 d后不定根伸长，在添加IBA的培养基中生根率较低;在仅添加了NAA的培养基中生根率较好但根系易形成棉絮状断根（图4A）;添加0.1 mg/L ZT和0.5 mg/L NAA的培养基中，第30天基部形成愈伤组织，不定根萌发，60 d后不定根伸长（图4B、图4C）。如表7所示，在添加了不同植物生长调节剂的WPM培养基中;生根率随着生长调节剂的种类与浓度变化，均存在显著差异，平均根长仅5号处理存在差异，其他无显著差异，平均生根数2号与6号处理无显著差异，其他组合存在显著差异;5号处理中生根率、平均根长、平均生根数显著高于其他组合，未添加植物生长调节剂的对照组，生根率为0;因此，生根培养基最佳组合为WPM+0.1 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA。

3  讨论

污染问题一直是影响植物组织培养是否成功的关键因素之一[10]，前人研究表明，高山杜鹃组织培养以HgCl2为主要表面消毒剂时，外植体处理5～10 min作用效果较好[6-7， 11-12]。本研究得出10月份取材，对龙源‘四季杜鹃古树HgCl2处理，成功率随着消毒时间增加先上升后下降，以消毒8 min效果最好，成功率为44.6%;为优化无菌系建立的成功率，对材料进行不同时间取材对比，10月份取材时，外植体生理较老化，消毒和不定芽诱导困难，成功率较低;3月份取材，当年新生枝条较短，几乎只能采集到1 cm左右长的茎尖，外植体消毒困难，成功率低;6月份为梅雨季节，连续的阴雨天容易滋生细菌，导致外植体的污染率更高;龙源‘四季杜鹃的生长旺盛期在5月份。试验结果表明，5月中旬的晴天取幼嫩的顶芽，成功率最高，达到66.7%，这与钟宇等[4]研究结果相似，在3—5月植物处于生长旺盛期，接种成功率较高。国内外近些年以叶片或花蕾作为外植体建立杜鹃组培快繁技术体系也较多[13-16]，Tomsone等[17]也在对常绿杜鹃‘伊琳娜的研究中指出，花蕾芽作为外植体更容易控制污染。龙源‘四季杜鹃已有400年以上树龄，树体表面及内生菌严重，其生存环境差、生理年龄较高、生命活性弱等都给无菌系建立带来了阻碍，可尝试以叶片或花蕾为外植体建立无菌系，是否能够提高成功率还有待试验。

‘四季杜鹃古树的取材有限，生长环境差，枝条携带病原菌和内生菌严重，在无菌系建立中，通过表面消毒，可去除外植体表面的病原菌，但无法去除体内的内生菌，内生菌主要通过维管束运输到培养基中，引起外植体的再次污染。因此，将污染的外植体重新消毒转瓶再培养，可提高接种材料的利用率和成活率，节约外植体。唐映红等[18]在无菌系建立阶段将外植体经过反复转瓶的方法消除茎段中的内生菌，得到无菌幼芽;参考前人经验，本研究将污染的外植体进行再1次消毒处理，帮助消除外植体表面的寄生菌，再经过4次转瓶，减少外植体切口处分泌的内生菌（此方法还没有文章提到过）;通过不同消毒方式对比，以酒精20 s+0.1% HgCl2 5 min处理和4次转瓶后，成功率达到71%，有效挽救了污染的外植体，提高外植体的利用率。

培养基种类及植物生长调节剂对组培苗生长发育有显著影响。初代培养在1/4 MS培养基中的杜鹃叶片出现卷曲，在WPM培养基中杜鹃长势较好。增殖培养中，在植物生长调节剂共同作用下，WPM培养基中的杜鹃部分容易出现玻璃化现象，Anderson培养基中杜鹃长势较好;1/4 MS和WPM对杜鹃枝条培养的不适宜性可能与培养基中矿质营养素的浓度有关，杜鹃花科植物适宜生长在低pH和低营养状况的土壤中[19]，表明用于这类植物组织培养的培养基应为低离子浓度[20]，在Anderson培养基上表现较好的生长状况可能由于其离子浓度较低，适宜‘四季杜鹃古树的生长。此外，增殖培养阶段带腋芽茎段比顶芽更适宜增殖培养，无论培养基或植物生长调节剂如何腋芽的增殖系数都比顶芽高，这在诱导迷人杜鹃和迎紅杜鹃从生芽上也得到同样的结果[21-22]。

由于‘四季杜鹃古树生理年龄大，对低强度的细胞分裂素反应迟钝，因此，在本研究中使用了高强度的细胞分裂素（ZT和TDZ）。试验结果表明，不同强度的细胞分裂素对‘四季杜鹃古树继代增殖效果上存在明显差异，由于TDZ的强度高于ZT，TDZ和NAA浓度及其相互作用显著影响愈伤组织和芽的形成，其愈伤诱导率比ZT与NAA组合的培养基高，添加0.5 mg/L TDZ的培养基，增殖系数达到13.23，是ZT培养基组合的2倍;但是在不定芽诱导的质量上，TDZ组合的培养基上诱导的无菌苗，多数呈簇生状，细弱矮小;虽然TDZ能快速有效地诱导外植体产生不定芽或丛生芽，但抑制了不定芽的伸长[12， 17]，影响无菌苗的质量;因此，在TDZ组合培养基中诱导的不定芽，必须转接到不含TDZ的培养基中进行壮苗培养，提高无菌苗质量;而ZT组合培养基诱导的不定芽或丛生芽生长正常，无菌苗长势较好，无须进行壮苗培养，该结果与郭颖等[23]和Preece等[24]在杜鹃组培快繁上的研究结果相一致。

在一般组培快繁的生根培养中，通常使用低大量元素的基本培养基，去除培养基中的细胞分裂素，只加入生长素，Wei等[25]在云锦杜鹃的生根培养中，基本培养基为WPM，只添加了1.0 mg/L的IBA，其生根率达84.0%;而在‘四季杜鹃古树的生根培养中，虽然在WPM基本培养基中添加了1.0 mg/L的IBA，其生根率很低，仅为11.8%，NAA的生根效果显著高于IBA，这与王育选等[26]的试验结果一致;本研究中，在生根培养基中添加低浓度的ZT，能有效刺激无菌苗的生根，生根率显著提高，这可能与‘四季杜鹃古树的生理年龄有关，生理年龄大，对生长素的反应迟钝，需要细胞分裂素的刺激来启动根原基的细胞分裂，‘四季杜鹃古树的最佳的生根培养基为WPM+0.1 mg/ LZT+0.5 mg/L NAA，其无根苗的生根率达92.6%。

裴东等[3]指出，组织培养技术为树木的复幼提供了一个良好的实验体系，试验诱导产生的不定芽使形成的植株表现出一定程度复幼，且连续多次继代培养可使许多成熟树木的分生组织复幼;本研究对‘四季杜鹃古树组培快繁体系的建立，帮助古树恢复其幼态特征，如提高生根能力等;前期的实验研究也为后面移栽打下基础，这对古树保护利用具有重要意义。

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