α-淀粉酶产生菌的分离、筛选及鉴定

2020-08-06陆小翠邓加聪

中国酿造 2020年7期

郑虹，陆小翠，邓加聪，2

（1.福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院，福建福清 350300；2.近海流域环境测控治理福建省高校重点实验室，福建福清 350300；3.现代设施农业福建省高等学校工程研究中心，福建福清 350300）

淀粉酶是一类水解淀粉和糖原的酶类总称，可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、异构淀粉酶等[1-2]。淀粉酶作为一类重要的工业酶，广泛应用于饲料、食品、发酵、医疗等领域[3-5]。在制糖、酿酒行业中，淀粉的糊化、液化、糖化等过程大多是在高温下进行的[6]，因此淀粉加工过程中需要耐高温的淀粉酶，否则会耗费大量的冷凝水，提高淀粉加工的成本[7-9]。

自然界中能分泌合成α-淀粉酶的主要微生物有黑曲霉[10]、扣囊复膜孢酵母[11]、芽孢杆菌[12]、古细菌[13]等。目前关于α-淀粉酶的研究主要集中在产α-淀粉酶菌株的分离筛选及选育、产酶发酵条件的优化及酶学特性研究等[11，13]。ROHBAN R等[14]在高盐度的湖泊中分离出可产淀粉酶、蛋白酶等多种酶类的极端微生物；谢建华等[15]从酒厂附近的土壤中分离筛选到一株产淀粉酶的解淀粉芽孢杆菌。本实验从温泉中分离筛选到一株产高温淀粉酶的菌株，对该菌株进行了初步鉴定分析，为该菌在酿酒、制曲等生产中的应用奠定一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

分离样品：福建省旗山温泉的底泥（40 ℃）；

生工SK8255柱式细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提试剂盒、TaqDNA聚合酶、琼脂糖、DNA Marker、正向引物16S-F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）、反向引物16S-R（5'-AGGAGGTGATCCAGCCG-CA-3'）等（均为分析纯）：生工生物工程（上海）有限公司；蛋白胨、酵母粉、麦芽糖、可溶性淀粉、乙醇等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 培养基

分离/斜面培养基：蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，酵母粉5 g/L，可溶性淀粉2 g/L，琼脂20.0 g/L，pH 7.2；

富集培养基：蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，酵母粉5 g/L，可溶性淀粉2 g/L，pH 7.2；

发酵培养基：可溶性淀粉10 g/L，NH4Cl·12H2O 8 g/L，豆粕粉30 g/L，CaCO31 g/L，pH 7.0；

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，MaCl 5 g/L，pH 7.0。

以上培养基均在121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Bio-Rad公司；FA2204B型电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司；SPX-150B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司；722SP分光光度计：上海棱光技术有限公司；TG16-WS高速台式离心机：上海湘仪有限公司；THZ-C台式恒温振荡器：太仓市华美生化仪器厂；SW-CJ-2FD超净工作台：福州伍联医疗器械有限公司；CDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1α-淀粉酶产生菌的富集培养

取1 g土样接种于富集培养基，40 ℃、150 r/min振荡培养24 h。

1.3.2α-淀粉酶产生菌的分离与初筛

将上述富集液稀释涂布于分离培养基，40 ℃倒置培养24 h。采用点接法，将单菌落用灭过菌的牙签点接于分离培养基平板，40 ℃倒置培养24 h后，加入碘液，分别测量透明圈直径与菌落直径，并算出二者比值，将比值大的菌落接种于试管斜面。每个菌株做3个重复。

1.3.3α-淀粉酶产生菌的复筛

将初筛得到的菌株接种于试管斜面，40 ℃活化培养24 h；挑取活化后的菌株1环，接种于液体发酵培养基中，150 r/min振荡培养24 h；将活化后的种子液按3%（V/V）的接种量接种于液体发酵培养基，40 ℃、150 r/min振荡培养48 h，发酵液8 000 r/min离心10 min，测定发酵上清液中α-淀粉酶的活性。每株重复3个平行。

1.3.4α-淀粉酶产生菌的形态特征及生理生化实验

将试管保存的菌株划线接种于LB固体培养基，40 ℃倒置培养24 h。

参考文献[16-17]对α-淀粉酶的产生菌进行形态观察及生理生化研究。

1.3.5 菌株16S rDNA基因序列的测定与分析

菌株基因组DNA按照试剂盒说明书进行提取。采用细菌通用引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为：纯化的PCR产物（10 ng/μL）1 μL、2.5 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP）8 μL、Taq酶0.2 μL，引物（3.2 pmol/μL）1 μL，加灭菌的去离子水10 μL。PCR扩增条件为96 ℃预变性1 min；96 ℃变性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，循环25次；60 ℃再延伸10 min，4 ℃保温。

16S rDNA基因序列测序委托上海生工生物工程股份有限公司完成。测序序列与美国国家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）网站的已知序列进行blast。采用MAGE4.0软件中的邻接法（neighbor joining，NJ）算法（BootStrap的设定值为1 000）构建系统进化树[18-19]，进行菌株系统发育分析。

1.3.6 温度对菌株生长的影响

将菌株接种于试管斜面活化24 h；挑取活化后的菌株1环，接种于液体发酵培养基中，40 ℃、150 r/min振荡培养24 h；将活化后的种子液按3%（V/V）接种量接种于发酵培养基中，在不同温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）条件下，150 r/min振荡培养24 h，测定发酵液OD600nm值。

1.3.7 酶活力测定方法

发酵液8 000 r/min、4 ℃离心10 min，其上清液即为粗酶液。淀粉酶活力的测定采用3,5二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid）法[20-22]。

α-淀粉酶酶活单位定义：pH 5.5，温度为60 ℃的条件下，1 mL酶液1 min水解淀粉产生1 μg葡萄糖的酶用量为1个酶活单位（U/mL）。

式中：C为从标准曲线上查的的葡萄糖含量，mg；VT为淀粉酶原液总体积，mL；VS为反应所用的α-淀粉酶原液体积，mL；W为样品的质量，g；t为反应时间，min。其中VT=25 mL，VS=1 mL，T=5 min，W=0.001 g。

2 结果与分析

2.1 高产α-淀粉酶菌株的分离筛选

2.1.1 高产耐高温α-淀粉酶菌株的分离

通过富集培养、稀释涂布及平板分离等方法，从土壤中分离筛选到10株透明圈直径（D）与菌落直径（d）比值比较大的菌株。结果见表1。

表1 α-淀粉酶产生菌的初筛结果Table 1 Preliminary screening results of α-amylase-producing strain

由表1可知，不同菌株产α-淀粉酶活性有一定的差异，根据菌株的D/d值，可以看出所筛选得到的菌株产α-淀粉酶活性的强弱如下：FA4＞FA8＞FA3＞FA5＞FA10＞FA1＞FA2＞FA9＞FA7＞FA6。

2.1.2 高产耐高温α-淀粉酶产生菌的复筛

将初筛得到的10株D/d值较大的菌株进行摇瓶复筛，发酵培养24 h，测定该菌株产α-淀粉酶的酶活力，结果见图1。

图1 淀粉酶产生菌的复筛结果Fig.1 Secondary screening results of amylase-producing strain

由图1可知，菌株产淀粉酶活性强弱如下：FA4＞FA8＞FA1＞FA7＞FA10＞FA6＞FA5＞FA9＞FA2＞FA3，与菌株D/d值有一定的差异，其中菌株FA4的淀粉酶活性最强，其酶活可达71.56 U/mL。所以选择菌株FA4进行后续实验。

2.2 菌株FA4的签定

2.2.1 菌株FA4的形态特征及生理生化实验

图2 菌株FA4的形态观察结果Fig.2 Morphological observation results of strain FA4

由图2可知，菌株FA4在LB固体培养基上培养24 h后，菌落呈乳白色，表面较湿润，不透明，隆起，边缘光滑。显微镜下观察该菌体呈杆状，革兰染色为阳性。参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行生理生化实验，结果见表2。

表2 菌株FA4与芽孢杆菌的生理特征比较Table 1 Physiological and morphological characteristics of strain FA4 and Bacillus sp.

由表2可知，菌株FA4能利用柠檬酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐及丙二酸，能分解过氧化氢，能水解淀粉和酪氨酸，甲基红试验呈阳性，V-P试验呈阳性，吲哚试验和苯丙氨酸脱氨酶试验阴性。

2.2.2 菌株FA4的16S rDNA序列分析鉴定

将提取到的菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增产物大小约为1 375 bp的16S rDNA基因。将所得到的16S rDNA基因序列进行测序，测序后，与NBCI网站上的数据库进行序列同源性比对，结果显示该菌株序列与Bacillus thuringiensis的多菌株具有99%以上的同源性。抽取若干条同源性较高的序列进行系统进化树的构建，结果见图3。

图3 菌株FA4的序列分析Fig.3 Sequence analysis of the strain FA4

由图3可知，菌株FA4的基因序列与登录号NR043403.1、MN643161.1的16S rDNA序列的同源性达到99%，表明菌株FA4与Bacillus thuringiensis亲缘性最近。再结合菌株的形态及生理生化特征，将该菌命名为苏云金芽孢杆菌FA4（Bacillus thuringiensis）。

2.3 培养温度对菌株FA4生长的影响

不同的培养温度对菌株FA4生长的影响结果见图4。由图4可知，菌株的OD600nm值随着培养温度的升高，逐渐升高，当培养温度达到40 ℃时，OD600nm值达到最大值，表明40 ℃是该菌株的最适生长温度；之后，随着培养温度的升高，生物量反而逐渐减少，当培养温度为55 ℃时，菌体仍有一定的生长，表明该菌株具有较强的耐热性。