利用微生物生物转化大黄的研究进展

文 雅，于雪荣，王泓午，郝 征，邢竹青

（天津中医药大学健康科学与工程学院，天津 301617）

传统的中药提取主要是水煎或醇提法，但随着现代发酵酿造工艺的不断发展，利用微生物对中药进行生物转化成为一种新的趋势。微生物在发酵中药时，可以产生一些能够分解转化物质能力的微生物，并能够产生一些次生代谢产物，最终扩大用药范围，增强药物的疗效[1]。

现代微生物学研究表明，大黄能增加肠蠕动，保护肠道黏膜功能[2]；大黄有抗感染作用，对许多革兰氏阳性和阴性细菌，如脆弱类杆菌、单形类杆菌等均有一定的抑制作用[3]；大黄对流感病毒和假狂犬病毒的灭活作用也十分明显，且对艾滋病病毒、霍乱毒素也有一定的抑制作用[4]；大黄有利胆和健胃作用；此外，还有调节免疫、清除氧自由基、致泄、保肝利胆、保护心脑血管、改善微循环、抗肿瘤等作用[4]。目前，已有很多报道表明，大黄可以有效抑制食源性致病菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌），并能应用于食品保藏和农业生产中[5-7]。

本文将从大黄创新发酵技术优势、大黄发酵技术菌株种类和研究现状、发酵技术目前的局限性几个方面进行阐述，为今后发酵大黄的规模化生产提供指导和参考。

1 大黄传统炮制的不足与大黄创新发酵技术的优势

随着中药市场需求的增大，传统炮制加工方法带来的有效成分利用率低，药效不稳定，加工过程繁琐等问题也日益凸显。大黄的传统炮制方法也正存在上述问题（见表1）。

表1 传统大黄炮制的不良影响Table 1 Adverse effects of traditional rhubarb processing

大黄生用泻下作用剧烈，易引起腹痛、恶心等胃肠道反应。因此，在实际治疗过程中，常经不同的煎煮、加辅料炮制成各种炮制品，从而缓解大黄的泻下作用及对胃肠道的不良反应。然而，大黄煎煮过程愈长泻下作用愈弱，煎煮大黄不仅引起结合蒽醌的水解，还会导致游离蒽醌的降解，甚至还存在蒽醌类成分间的化学转化[8-9]。国外报道长期应用大黄中蒽醌类成分可致肝、肾损害以及潜在的致癌风险[10-13]。这些问题都给大黄临床应用过程提出了很高的要求。所以，进一步完善并创新大黄制剂的提取精制工艺，以减少蒽醌类成分的损失，对中药大黄的高效利用及推广有重要的现实意义[14]。

随着现代发酵技术的飞速发展，利用微生物进行发酵加工，较传统炮制方法已有明显优势，主要体现在：（1）有利于实现中药发酵技术的标准化，专业化。在继承传统的中药发酵技术的基础上，利用现代微生态学的成果知识，结合现代微生物工程形成的中药制药新技术，完成一些常规炮制方法难以实现的反应，较大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用[21]。（2）有利于在中药创新研究领域开辟新的研究方向。近年来对于中药药用功能的研究越来越深入，但却缺乏制药过程的创新和进步，此举极大的阻碍了其实际临床应用中的稳定性。通过采取更为经济、安全、无污染的中药发酵技术对中药进行加工，开辟了其炮制过程的新角度和新思路。（3）有利于筛选具有我国自主知识产权的生物转化菌株。我国目前利用微生物发酵法进行中药生物转化还处于刚刚起步的阶段，发酵菌研究多集中于真菌[22]，大多使用常见的益生菌株进行发酵。所以，为了取得更好的生物转化效果，需要不断搜集菌株的资源，为形成我国具有自主知识产权的中药生物转化菌株库奠定坚实基础[23]。

2 中药大黄发酵技术国内外研究现状

国内应用的发酵工艺主要采用固体发酵[24]。在适宜的培养基上培养，收集微生物自身的生长代谢和生命活动产生次生代谢产物。但利用中草药发酵生产药物的研究起步较晚，20世纪80年代的研究主要集中在真菌类自身发酵，多为单一发酵产生次生代谢，如灵芝菌丝体、冬虫夏草菌丝体发酵等[25]。现代利用中草药发酵的研究已从单味药扩展到复方研究且取得显著成果，杨海龙等[26]借助真菌灵芝产生的丰富酶系通过对薏苡仁的转化，使薏苡仁的主要成分发生了变化。“康复灵”为抗癌验方，主要成分有灵芝发酵菌、党参、麦冬、猪苓、薏苡仁、淮山药等，经生物发酵转化后多数样品具有抑制小鼠肉瘤生长的作用[27]。有研究使用酵母粉发酵大黄粗粉，发酵后，结合型蒽醌含量降低，游离型蒽醌含量增加6倍左右[15]。段维和[28]使用9株真菌对大黄进行发酵改性研究，发现经疣状毛癣菌发酵后抗菌活性明显增强，游离型蒽醌含量增加3倍左右。刘洋等[29]使用多种益生菌组合（干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母）制成菌剂后，应用于发酵复方中草药（王不留行和益母草），发现可溶性总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷含量明显提高。类似使用益生菌发酵大黄也有报道，明显增强对于大肠杆菌的抑制作用[30]。

近年来，发酵药材越来越受到研究者重视，在韩国和台湾的学术界引起研究热潮。有研究发现，蛹虫草菌发酵的五味子药渣能够提高仔猪的免疫功能[31-32]。陈茂彬[33]从根际土壤筛选到一株能转化藜蒿黄酮类物质的菌株，根据形态及显微结构特征可以初步鉴定为芽孢杆菌属菌株，转化后的总黄酮量是转化前的7.56倍。国外对于中药发酵的研究主要集中在酶和食品工程领域，在食品分析检测过程中，以酶作为分析试剂，在基础研究方法、检验仪器和设备、酶试剂的来源和储存、标准分析方法的制定以及应用范围上均领先于国内[33]。如对肉桂的研究，肉桂的菌丝和子实体在预防和治疗肝病方面具有潜在价值，有望被开发成保健食品或新药。而发酵和栽培技术的应用使这种药用蘑菇的菌丝和子实体更容易获得[34]。又如日本的纳豆，用芽孢杆菌发酵大豆，利用芽孢杆菌中酶系丰富且能增加维生素K含量的特点，消除小肠内致病菌，其提取物也具有明显的抗癌活性和降压作用[35]。也有用真菌曲霉接种到大黄中，然后测定发酵和未发酵的大黄提取物的化学成分以及抗氧化、抗菌、抗癌的活性的相关报道[36]。

目前，大黄发酵的研究还处于初级阶段，已有的国内相关研究报道较多，主要研究目标集中在发酵菌株的筛选及蒽醌类型的转化；国外研究相对较少，主要致力于有效物质结构和含量的转化分析[37-38]。由于应用现代科技技术对其展开科学研究时间较短，系统、成熟的利用微生物转化技术还鲜见报道。现有成果距离形成可供实际规模化生产尚有较大差距，有必要借鉴上述成功的经验，进行进一步深化的研究探讨。

3 大黄发酵技术菌株种类

3.1 酵母菌作为发酵菌株

酵母菌作为发酵工业中的常用菌之一，在发酵大黄的研究中也被报道有很好的生物转化效果。发酵后，使大黄中的结合型蒽醌有效地转化为游离型蒽醌，从而降低大黄的峻泻作用，进而降低对胃肠道或其他的不良反应。

高洁等[39]通过实验证实，利用酵母菌发酵大黄，在一定条件下，游离型蒽醌的转化率可达到42.369%。戴万生等[15]研究发现，大黄经酒精酵母、面包酵母分别发酵后，总蒽醌含量略有降低，分别为生品的97.8%、98.2%，与有关文献[40]比较，发现传统的炮制方法均普遍使大黄总蒽醌含量明显降低，说明发酵法有利于保存大黄总蒽醌，发酵法优于传统的炮制方法。同时，大黄经酒精酵母、面包酵母分别发酵后，结合型蒽醌含量降低，分别为生品的52%、48%，而游离型蒽醌含量大大增加，分别为生品的594%、648%。说明发酵法也能使大黄结合型蒽醌有效的转化为游离型蒽醌。马超等[41]通过实验筛选到酵母菌株KM12，经26S rRNA分子鉴定为马克思科鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），用菌株KM12发酵法炮制中药大黄，能够使结合型蒽醌分解或转化成游离型蒽醌，从而缓和大黄的峻烈泻下作用。

3.2 霉菌和蕈菌作为发酵菌株

吕平[42]优化了菌株素赭曲霉（Aspergillus ochraceus）LP-0301，通过钠离子注入获得大黄素高产菌株，并且优化了发酵条件，使其最终产率达1.453 mg/L，比出发菌株提高2.96倍。因此由菌株LP-0301发酵产大黄素的含量较药用植物高，有很好的开发价值。

邬吉野[43]通过建立槐耳大黄双向发酵体系，明显提高了大黄的转化。研究结果显示，经槐耳双向发酵后，结合型蒽醌含量降低明显，游离型蒽醌含量增加明显，说明发酵法能使大黄结合型蒽醌转化为游离型蒽醌，从而缓和大黄峻泻作用，且双向发酵后槐耳大黄菌质体系有新成分产生，并有一定的抑制肿瘤效果。

3.3 益生菌作为发酵菌株

由于益生菌在肠道功能改善研究中的突出表现，也有学者探讨了利用不同益生菌发酵大黄后的产物变化。韩佳慧等[30]通过利用益生菌N-14对大黄进行发酵，发酵大黄与水煎液大黄相比，对大肠杆菌的抑制作用大大增强。王惠芸等[44]在双歧杆菌对12种中药的发酵与抗菌活性检测分析中发现：12种中药通过双歧杆菌的发酵作用，使得抗菌活性发生不同程度的变化。但大黄发酵前以及发酵之后对于细菌的抑制作用并没有非常明显的变化。

3.4 内源菌群发酵

利用内源菌群相对来说简单易得，因此很多学者也对此进行了摸索。王楠[45]利用植物大黄地上叶片部分中存在的一种内生真菌-叶点霉菌为发酵菌株，R7269大黄酸为标准品，对实验条件多次优化后，测得叶点霉发酵液中总蒽醌类物质的平均得率可达23.96 mg/g。于志伟等[46]以一株分离自高原掌叶大黄的腐皮镰刀菌R13为研究对象，通过调节初始pH以及添加丙酸和丙二酸，可以促进该菌生产大黄素，最终大黄素产量可达3.908 mg/L，有望成为大黄素高产菌株。

3.5 外源菌株发酵

目前，用于大黄发酵的菌株也有来自其他植物或动物资源，经过生物转化后的活性物质可用于抗氧化或改变肠道菌群结构。

杨玉红等[47]以自主筛选的软枣猕猴桃内生真菌Z2为发酵菌株，研究发现经发酵后的大黄可生产具有多功能抗氧化活性的蒽醌，蒽醌类物质质量浓度为100 μg/mL时，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力为72.27%，对超氧阴离子的清除能力为13.33%，对烷基自由基的清除能力高达76.75%。王瑞风等[48]研究认为，大黄酸经小鼠本身的菌群作用后，可增加糖尿病小鼠肠道中的拟杆菌，同时减少硬壁菌，使拟杆菌与硬壁菌的比例升高，而已有研究表明，拟杆菌比例的下降可以导致代谢紊乱[49]。

4 大黄发酵技术的局限性

就大黄本身来说，我国尚缺乏生物转化大黄的深入研究。虽然目前已有多种微生物种类应用于大黄的发酵条件摸索，但存在实际应用生产转化率不高的现实问题。发酵后的大黄所含成分及药理作用的影响，也有待进一步研究发展。虽然我国的发酵技术历史悠久，但中药菌株发酵技术仍处于起步阶段，存在诸多亟待解决的问题，例如：单一菌种与混合菌种之间的选择，单味中药与复方中药之间的权衡，体内发酵与体外发酵的比较，生物制品和创新药物的定位问题等[50]。对中草药的成分进行生物转化，进而确定转化前后药效的变化，需要微生物学、中医学、中药学、分析化学、药理学等多学科参与。同样，存在于发酵大黄开发中也有一系列的疑问需要解开：微生物发酵体系构成如何、发酵时是否改变了大黄的药效成分，微生物代谢是否产生了新的成分，发酵后的大黄产物对于肠道疾病的作用效果如何？存在何种作用机制？这些无疑是一个个巨大的挑战。

5 展望

利用微生物进行食品行业中的酿造和品质改良的传统由来已久，也已取得非常突出成果，但是利用发酵技术转化中药成分还处于初级阶段，拥有巨大的发展潜力。发酵工程和酶工程已被列为中医药领域创新转化的重要项目之一，其中发展传统中医药，是实现中药现代化、具有高科技水平的新技术[30]。有学者呼吁将单味中药、具有类似或协同作用的中药进行发酵，以达到产生新化合物、增强功效或者降低单一药物不良作用的效果。中药经发酵、生物转化后，其有效成分能被充分分离、提取；经生物转化更具有生物活性，在中药现代化过程中具有重要地位。由此，在大黄的有效成分转化过程中，借助中药发酵技术，研究大黄发酵现状的意义得以凸显。应用现代生物技术大规模工业化提取中草药的有效生物活性成分，发展具有中国特色的生物技术医药工业具有广阔的前景。