基于骨组织Dlx5启动子甲基化探究补肾中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠的疗效机制

王剑 刘剑辉 李屹 王实 刘研 丰雪妮 刘永林 刘文艳 宋光熠 郑洪新

1.辽宁省基础医学研究所，辽宁 沈阳 1101012.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是原发性骨质疏松Ⅰ型，特征为骨量减少、显微结构退化、脆性增高，临床常表现为腰背酸痛、驼背、变矮、易骨折，直接原因是女性绝经后雌激素水平下降导致骨重建失衡，中医药防治疗效肯定，但作用机制不清楚。近年研究发现，表观遗传调控重要组成之一的DNA甲基化通过调控骨质疏松相关基因的表达，影响骨质疏松的发生、发展[1]。本研究以成骨细胞分化中起关键作用的远端缺失同源盒5(distal-less homeobox 5，Dlx5)[2]基因启动子甲基化水平为效应指标，探索基于中医“肾主骨”理论指导的补肾中药复方的疗效机理，为中医药防治PMOP提供表观遗传学实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar雌性(未曾交配)大鼠61只，3月龄，体质量(240±20)g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司(辽宁省实验动物资源中心)，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。动物饲养于辽宁省基础医学研究所药理实验室(国家中医药管理局二级实验室)，室温20 ℃～25 ℃，相对湿度35%～65%，喂以大小鼠维持饲料(辽宁长生生物技术股份有限公司)。

1.2 分组与造模

大鼠购进，适应性饲养4 d后，完全随机分出12只为正常组，余者行双侧卵巢摘除术：3%戊巴比妥钠腹腔注射(35 mg/kg)麻醉，腹部切口摘除双侧卵巢。术者完全随机分为模型组12只、补肾中药复方组18只、仙灵骨葆阳性对照组19只。灌胃期间，仙灵骨葆阳性对照组大鼠死亡1只，取材大鼠共计60只。

1.3 实验药品及给药剂量与方法

1.3.1实验药品：补肾中药复方：马鹿茸冻干粉(辽宁宏宇生物科技有限公司)、淫羊藿颗粒(规格：颗粒100 g相当于饮片2 100 g，四川新绿色药业科技发展有限公司)、纳米牡蛎壳微粉(平均粒径780 nm，长山岛大连湾)；阳性对照药仙灵骨葆胶囊[由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄组成，国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，国药准字Z20025337，批号180417]。

1.3.2给药剂量与方法：大鼠等效剂量按成人(体质量60 kg)6.3倍计算，给药容积：1 mL/100 g。正常组和模型组给生理盐水；补肾中药复方组给补肾中药复方[马鹿茸冻干粉0.315 g/(kg·d)、淫羊藿颗粒0.15 g/(kg·d)、纳米牡蛎壳微粉1.05 g/(kg·d)]；仙灵骨葆阳性对照组给仙灵骨葆胶囊粉0.315 g/(kg·d)。术后6 d开始，每日灌胃1次(每灌6 d，休息1 d不灌)，连续14周。

1.4 主要仪器

X射线骨密度测定仪(STRATOS DR，Diagnostic Medical System SA，法国)、MassARRAY Nanodispenser(RS1000，SEQUENOM)、S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)、PCR仪(96孔，BIORAD)等。

1.5 主要试剂

QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，51304)、PCR Accessory Set(SEQUENOM，11327)、EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO，D5005)、MassCLEAVE Kit(SEQUENOM，10129.1)、Spectro CHIP®Arrays and Clean Resin Kit(SEQUENOM，10117)等。

1.6 指标检测

1.6.1骨密度(bone mineral density，BMD)：取第1～6腰椎，剔除附着之软组织，用生理盐水冲洗，包以生理盐水浸湿的医用纱布，外包锡纸，写好编号，-80 ℃冰箱冻存。应用X射线骨密度测定仪(STRATOS DR)检测大鼠离体第1～6腰椎骨密度，精细模式扫描，用仪器附带的DMS小动物骨密度分析软件(版本：V4.0.7.1)分析骨密度值，以单位面积的骨矿含量(g/cm2)表示。

1.6.2Dlx5启动子甲基化水平：取双侧股骨头，剔除附着之软组织，用生理盐水冲净血污，无菌吸水纸吸干，装入对应编号的液氮冻存管，拧紧管盖，液氮速冻0.5 h后，-80 ℃冰箱冻存。质谱法检测：①引物设计：检测片段：Dlx5基因启动子-470 bp至-4 bp(序列：GCAGGCTGACTGTTGGCTGAGGCGCA GCACAGCCTTGGTTAAATCCTTAATTGCGCGCTTA CGCACAGCGGGGTGGATCGGGTTCCATTGGCCAG GGCCTCGGGAGCAGAGCAACACCCTAACTCGTTC AACTAGTTTTAGCACAACAAAGCATTGCTTAAAA AAGAGAGAGGGGGGGGGCGTACAAGGAGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG AGAGAGAGAGAGAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGAG AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTG TACGTGTTGTTGCCTGTTGGGGGAGGCAGGGTCTC AGTCGATCTGTTTTTAGTGAATAGCTGCTACAAAT CAAGCAGTTCCAGGGCCCAGCTCTGTGCTGTT)，长度467 bp，CpG位点总数11个，能检测到10个CpG位点。引物设计使用 Sequenom 公司 Epidesigner(http://www.epidesigner.com)，修饰后的上游引物：aggaagagagGTAGGTTGATTGTTGGTTGAGG，修饰后的下游引物：cagtaatacgactcactatagggagaaggct AACAACACAAAACTAAACCCTAAAA。引物设计完成后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。②DNA提取：使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)试剂盒提取骨组织DNA。③重亚硫酸盐处理：使用PCR仪(96孔，BIORAD)、EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO)试剂盒对DNA样品进行重亚硫酸盐处理，使未甲基化的C转变为U，甲基化的C不变。PCR仪程序：98 ℃，10 min→64 ℃，2.5 h→4 ℃，forever。④PCR扩增：使用S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)、PCR Accessory Set(SEQUENOM)试剂盒和步骤①设计合成的引物扩增重亚硫酸盐处理后的样品。PCR程序：94 ℃，10 min；(94 ℃，45 s；62 ℃，48 s，-0.5 ℃/cycle；72 ℃，1 min)10cycles；(94 ℃，45 s；57 ℃，48 s；72 ℃，1 min)35cycles；72 ℃，3 min；4 ℃，forever。⑤碱性磷酸酶处理(SAP)：使用S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)、MassCLEAVE Kit(SEQUENOM)试剂盒处理步骤④的PCR产物。PCR仪程序：37 ℃，20 min→85 ℃，5 min→4 ℃，forever。⑥体外转录(IVT)和RNase酶切：使用S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)、MassCLEAVE Kit(SEQUENOM)试剂盒将SAP处理后的PCR产物进行体外转录和RNase酶切。PCR仪程序：37 ℃，3 h→4 ℃，forever。⑦纯化，点样及质谱：使用Spectro CHIP©Arrays and Clean Resin Kit(SEQUENOM)试剂盒。先将酶切产物纯化，再用MassARRAY Nanodispenser(RS1000，SEQUENOM)将纯化产物点至384格式 Spectro CHIP (SEQUENOM)芯片上，将芯片放入MassARRAY Compact System (SEQUENOM)检测。Spectro CHIP 芯片使用 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术，检测数据用 EpiTYPER 软件(SEQUENOM)分析并输出结果。本实验质谱法检测甲基化由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 第1～6腰椎骨密度

与正常组比较，模型组第1～6腰椎骨密度明显降低(P<0.01)；与模型组比较，补肾中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组第1～6腰椎骨密度明显升高(P<0.05)；补肾中药复方组比仙灵骨葆阳性对照组第1～6腰椎骨密度有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠离体第1～6腰椎骨密度Table 1 BMD of the rat lumbar vertebra 1-6 in each

2.2 骨组织Dlx5启动子-470 bp至-4 bp甲基化水平

甲基化检测每组随机抽取8个样本送检，共计32个样本，补肾中药复方组有1个样本PCR失败了，故31个样本上质谱分析。Dlx5基因启动子检测片段-470 bp至-4 bp含有CpG位点11个，位点4未检测到，检测到10个CpG位点，位点11正常组有2个样本没分析出来。

与正常组比较，模型组CpG2.3甲基化水平明显升高(P<0.01)，模型组CpG1、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG10甲基化水平有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，补肾中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组CpG1甲基化水平明显降低(P<0.05)，补肾中药复方组CpG2.3、CpG5、CpG6、CpG7、CpG10、CpG11甲基化水平有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，仙灵骨葆阳性对照组CpG8、CpG10、CpG11甲基化水平有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表2。

表2 各组大鼠骨组织Dlx5基因启动子-470 bp至-4 bp甲基化水平Table 2 Methylation level of Dlx5 gene promoter -470 bp - -4 bp in bone of rats in each

3 讨论

表观遗传是研究基因序列不发生改变的情况下，产生基因表达的可遗传变化。表观遗传修饰是一种重要的基因表达调控机制，包括DNA甲基化、组蛋白修饰(甲基化、乙酰化、磷酸化等)、非编码RNA和微小RNA(microRNA)、染色质重塑等。近年研究表明，DNA甲基化、组蛋白修饰、microRNA可调控多种成骨、破骨相关基因的表达，从而影响成骨细胞和破骨细胞的分化和活性，参与骨质疏松的发生发展[3]。DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，在DNA甲基转移酶的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)为甲基供体，将其活性甲基转移到5’-CpG-3’二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上，是可逆的DNA自然化学修饰方式。启动子序列DNA甲基化抑制基因表达[2]，甲基化DNA与甲基化胞嘧啶结合蛋白(methylcytosine binding proteins，MeCP)结合，诱导染色质组蛋白脱乙酰基，构象改变，抑制基因转录[4]。第1外显子甲基化沉默转录[5]，可能因为第1外显子甲基化阻碍转录起始。基因体甲基化与基因表达水平呈正相关，可能因为基因体DNA甲基化抑制基因内启动子启动的假转录，从而实现5’基因启动子启动的有效转录[2]。Delgado-Calle等[6]研究骨质疏松性髋部骨折和髋关节炎患者骨全基因组甲基化谱，发现两组患者中：甲基化与基因表达之间存在全基因组负相关；甲基化差异显著的CpG位点共241个，分布于228个基因中，差异甲基化基因多为与细胞分化和成骨相关的基因，例如同源盒(homeobox，Hox)家族的基因，说明骨质疏松发病可能与这些基因甲基化改变相关。

同源盒超家族基因不仅在胚胎发生过程中对骨骼结构起重要作用，而且还影响成骨细胞的分化和活性[6]。Dlx5属于同源盒基因家族，通过调控靶基因Runx2、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白、I型胶原转录，促进成骨细胞分化，矿化骨基质[7-10]，对防治骨质疏松症意义重大。张志恒等[11]研究表明，健骨颗粒能明显升高去卵巢小鼠骨组织Dlx5 mRNA和蛋白表达，有效防治骨质疏松。本课题组前期研究表明，去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达明显降低，补肾壮骨中药复方可明显上调之，有效防治绝经后骨质疏松[12]。Zhang等[13]研究表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)上调Dlx5表达，说明Dlx5 DNA甲基化负调控其表达。Novakovic等[14]研究表明，妊娠期间Dlx5甲基化与其mRNA表达负相关。那么，去卵巢导致的骨组织Dlx5表达下降是否与其异常甲基化有关，补肾中药是否通过调节其甲基化而上调其表达，Dlx5异常甲基化是否与绝经后骨质疏松症的发病有关呢？

本研究基于中医“肾主骨”理论，依据PMOP“肾虚”的根本病机[12]，组补肾中药复方(鹿茸为君，壮肾益精、强筋健骨；淫羊藿为臣，补肾阳、强筋骨；佐以牡蛎，补肾、强骨节、潜阳补阴)，补肾以健骨，以临床治疗骨质疏松症疗效确切的同济堂仙灵骨葆胶囊(由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄组成，功效滋补肝肾、接骨续筋、强身健骨)为阳性对照药，以骨组织Dlx5基因启动子-470 bp至-4 bp甲基化水平为效应指标，探究PMOP的发病机制以及补肾中药复方的疗效机理。本研究采用经典方法切除雌性大鼠双侧卵巢建立PMOP动物模型[15]。结果显示，模型组大鼠第1～6腰椎骨密度比正常组明显降低，骨组织Dlx5启动子-470 bp至-4 bp CpG2.3甲基化水平比正常组明显升高。说明PMOP模型建立成功，去卵巢造成骨组织Dlx5启动子高甲基化，甲基化DNA与甲基化胞嘧啶结合蛋白结合，诱导染色质组蛋白脱乙酰基，构象改变，抑制其转录，下调其表达，进而下调其靶基因Runx2、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白、I型胶原的表达，抑制成骨细胞分化和成骨，导致骨质疏松。补肾中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组第1～6腰椎骨密度比模型组明显升高，骨组织Dlx5 启动子-470 bp至-4 bp CpG1甲基化水平比模型组明显降低。说明本研究补肾中药复方和仙灵骨葆可有效防治PMOP，通过降低去卵巢骨质疏松大鼠骨组织Dlx5启动子甲基化水平，降低甲基化DNA与甲基化胞嘧啶结合蛋白结合，染色质组蛋白乙酰化，赖氨酸残基掉正电荷，降低组蛋白与带负电荷的DNA的结合，促进其转录，上调其表达，进而上调其靶基因Runx2、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白、I型胶原的表达，促进成骨细胞分化和成骨，有效防治PMOP。从而证明绝经后骨质疏松症的发病机制之一可能是骨组织Dlx5启动子甲基化水平升高；补肾中药复方可能通过降低骨组织Dlx5 启动子甲基化水平，有效防治该病。