大黄鱼肝油提取工艺优化及品质分析

窦 鑫 吴燕燕 杨贤庆 胡 晓 王悦齐

(1. 中国水产科学研究院南海水产研究所农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州 510300；2. 上海海洋大学食品学院，上海 201306)

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)是中国特有的海洋鱼类，主要分布于东南沿海，尤其是闽浙沿海地区。2019年，中国鱼类产量4 991.06万t，而海水养殖鱼类中，大黄鱼产量最高，为19.80万t[1]。随着大黄鱼产量的逐渐增加，其速冻加工过程产生大量的内脏下脚料，而内脏中大黄鱼肝占比达36.65%[2]。

目前，有关大黄鱼肝脂质的研究较少[3]，而鱼肝中含有丰富的脂质。海水鱼油比陆生动物油脂更健康，含有更丰富的多不饱和脂肪酸[4]，特别是长链式二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有有益健康的作用[5-8]，此类多不饱和脂肪酸通常存在于从鱼类(如大黄鱼)提取的油脂中[9-10]。目前，从鱼肝脏中提取油脂的方法较多，主要有蒸煮法[7]、压榨法[11]、溶剂抽提法[12-13]、淡碱水解法[14]以及酶解法[15-18]等。酶解法具有生产条件温和、得率高、产品质量好的特点，蛋白酶水解原料产生的水解液富含氨基酸等物质可进一步加工利用[11]。试验拟以酶法提取大黄鱼肝中油脂，优化其提取工艺，并分析大黄鱼肝油的品质特性，旨在为其利用开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大黄鱼肝脏：宁德市金盛水产有限公司；

木瓜蛋白酶(20万U/g)、碱性蛋白酶(200 U/mg)：上海麦克林生化科技有限公司；

中性蛋白酶(200 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)：合肥博美生物科技有限责任公司；

胃蛋白酶：3 000～3 500 NFU/mg，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器设备

盐酸：分析纯，广州化学试剂厂；

14%三氟化硼—甲醇溶液：分析纯，上海安谱科学仪器有限公司；

氯仿、甲醇、氢氧化钠、正己烷和氯化钠：分析纯，广州辉俊生物科技有限公司；

韦氏试剂：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

石油醚：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；

气相色谱—质谱联用仪：QP2010型，日本岛津公司；

均质机：IKA-T50型，德国IKA公司；

台式低速离心机：TDZ5-WS型，湖南湘仪离心机有限公司；

脂肪分析仪：Soxtec TM 2050型，丹麦Foss公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 将大黄鱼肝脏经自然解冻后，使用组织捣碎机破碎，制备肝脏匀浆。

1.3.2 大黄鱼肝脂肪的测定 按GB 5009.6—2016执行。

1.3.3 酶解法提取大黄鱼肝油 称取适量经预处理后的大黄鱼肝匀浆于锥形瓶中，依次按不同的料液比及pH，并向其中加入一定量的酶，混匀。将锥形瓶置于恒温振荡器中，一定温度下进行酶解，105 ℃烘箱灭酶15 min，趁热离心，分离上层油相，备用。

1.3.4 单因素试验设计

(1) 酶种类：固定料液比1∶2 (g/mL)，酶用量1.5%，酶解时间3.5 h，分别用胰蛋白酶(50 ℃，pH 7.5)、木瓜蛋白酶(50 ℃，pH 6.5)、中性蛋白酶(50 ℃，pH 7.0)、碱性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)、胃蛋白酶(45 ℃，pH 2.5)进行酶解，考察酶种类对大黄鱼肝油提取率的影响。

(2) 料液比：固定中性蛋白酶添加量1.5%，酶解时间3.5 h，酶解温度50 ℃，pH 7.0，考察料液比[1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/mL)]对大黄鱼肝油提取率的影响。

(3) 中性蛋白酶添加量：固定料液比1∶2 (g/mL)，酶解时间3.5 h，酶解温度50 ℃，pH 7.0，考察中性蛋白酶添加量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)对大黄鱼肝油提取率的影响。

(4) 酶解温度：固定料液比1∶2 (g/mL)，中性蛋白酶添加量1.5%，酶解时间3.5 h，pH 7.0，考察酶解温度(40，45，50，55，60 ℃)对大黄鱼肝油提取率的影响。

(5) 酶解时间：固定料液比1∶2 (g/mL)，中性蛋白酶添加量1.5%，酶解温度50 ℃，pH 7.0，考察酶解时间(1.5，2.5，3.5，4.5，5.5 h)对大黄鱼肝油提取率的影响。

(6) pH：固定料液比1∶2 (g/mL)，中性蛋白酶添加量1.5%，酶解时间4.5 h，酶解温度50 ℃，考察pH值(6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)对大黄鱼肝油提取率的影响。

1.3.5 响应面试验设计 在单因素试验基础上根据SPSS显著性差异分析(P<0.05)，以酶添加量、pH、酶解时间、酶解温度为试验因素，以提取率为响应值，设计四因素三水平响应面试验优化大黄鱼肝油提取工艺条件。

1.3.6 理化性质分析

(1) 感官评价：按SC/T 3502—2016执行。

(2) 酸价：按GB 5009.229—2016执行。

(3) 碘值：按GB/T 5532—2008执行。

(4) 水分及挥发物：按GB 5009.236—2016执行。

1.3.7 大黄鱼肝油提取率的测定 按式(1)计算大黄鱼肝油提取率[14]。

(1)

式中：

c——大黄鱼肝油提取率，%；

c1——大黄鱼肝脂肪含量，g/100 g；

m1——大黄鱼肝脏质量，g；

m2——大黄鱼肝油质量，g。

1.3.8 脂肪酸成分分析 向大黄鱼肝油中加入14%三氟化硼—甲醇溶液2 mL，60 ℃水浴30 min，冷却，加入1 mL 正己烷和蒸馏水振荡摇匀。静置分层后，用注射器通过0.22 μm有机滤膜过滤获得上清液，上清液经GC-MS分析[19-20]。

(1) 色谱条件：色谱柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样温度250 ℃；分流比1∶30，进样体积1 μL，流速1.52 mL/min，载气为高纯氦；加热程序为110 ℃ 加热4 min，10 ℃/min加热1 min，然后4 ℃/min加热1 min；升温至210 ℃持续3 min，最后以4 ℃/min升温至240 ℃，并持续8 min。

(2) 质谱条件：离子源温度200 ℃；电源电压70 eV；溶剂延迟时间3 min。

1.4 数据处理

分别使用计算机NIST 0.5谱库数据库以及MS图库中的标准谱图进行检索与比较，确认大黄鱼肝油中脂肪酸甲酯成分，采用面积归一化法(以峰值面积的百分比表示)测定脂肪酸的百分含量[21-22]。各试验平行3次，结果表示为平均值±标准差。采用 Excel 软件绘图，采用SPSS统计分析软件的ANOVA和Duncan 法(α=0.05)分析鱼油脂肪酸含量，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶种类 由图1可知，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对大黄鱼肝油的提取效果较好，其中中性蛋白酶鱼油的提取率最大，为69.02%。综上，选用中性蛋白酶作为大黄鱼肝油的提取用酶。

图1 酶种类对大黄鱼肝油提取率的影响

2.1.2 料液比 由图2可知，大黄鱼肝油提取率随料液比的增加先增大后减少，当料液比为1∶2 (g/mL)时，提取率最大为72.13%。料液比过低，其酶浓度分布不均，故与底物间的反应不充分，导致提取率降低；而料液比浓度过高，底物的浓度就会减少，这样酶与底物的接触机会减少，提取率也会降低[23-24]。综上，选择最佳料液比为1∶2 (g/mL)。

图2 料液比对大黄鱼肝油提取率的影响

2.1.3 酶添加量 由图3可知，大黄鱼肝油提取率随酶添加量的增加先升高后趋于平稳，当酶添加量为1.5%时，提取率最高为72.13%。刘超等[23-24]研究发现鳕鱼肝油提取率随酶用量的增加而降低，可能与酶种类有关，酶用量过大，其水解能力加强，原料中的油脂被降解，提取率下降。故最适酶添加量为1.5%。

图3 酶添加量对大黄鱼肝油提取率的影响

2.1.4 酶解温度 由图4可知，大黄鱼肝油提取率随酶解温度的增加先升高后降低，当酶解温度为50 ℃时，提取率最大为72.13%，这是由于50 ℃是中性蛋白酶的最佳酶解温度，故此温度下大黄鱼肝油的提取效果最好。酶解温度过高或过低会使酶变性或失活，酶反应速率下降，鱼油提取率较低。故选择最适酶解温度为50 ℃。

图4 酶解温度对大黄鱼肝油提取率的影响

2.1.5 酶解时间 由图5可知，大黄鱼肝油提取率随酶解时间的增长先不断提高后趋于稳定。当酶解时间为4.5 h 时，提取率达最大，为71.49%。由于大黄鱼肝油经过长时间的酶解会导致鱼油被空气氧化，使大黄鱼肝油品质下降，故选择最适酶解时间为4.5 h。

图5 酶解时间对大黄鱼肝油提取率的影响

2.1.6 pH 由图6可知，大黄鱼肝油提取率随pH的升高先缓慢上升后迅速下降，当pH为7.0时，提取率最高，为71.36%。故选择最适酶解pH为7.0。

图6 pH对大黄鱼肝油提取率的影响

2.2 响应面优化设计

2.2.1 试验设计与结果分析 根据单因素试验结果，以大黄鱼肝油提取率为响应值，根据Box-Behnken中心组合原理进行响应面设计，试验因素水平表见表1，试验设计与结果见表2。

表1 试验因素水平表

表2 响应面试验设计与结果

利用Design-Expert 11.1.0.1软件对响应面试验结果进行多元回归拟合，得到以大黄鱼肝油提取率(Y)为响应值的二次多项式回归方程：

Y=69.79+1.84A+1.94B-1.54C+0.674 2D+3.93AB-0.207 5AC-1.35AD+3.29BC-2.02BD-3.19CD+1.94A2+0.925 0B2+1.81C2-7.81D2。

(2)

表3 方差分析†

2.2.2 试验因素间的交互作用 由图7可知，交互项AB、BC以及CD对大黄鱼肝油提取率存在显著影响(P<0.05)，交互项AC与AD对大黄鱼肝油提取率的影响不显著，与方差分析结果一致。

图7 各因素间的交互作用

2.2.3 验证实验 经响应面分析得最佳酶解工艺条件为中性蛋白酶添加量2.49%、pH 7.32、酶解时间4.01 h、酶解温度50.25 ℃，此条件下大黄鱼肝油提取率为79.05%。为检验响应面结果的可靠性，实际选取最优工艺参数为中性蛋白酶添加量2.5%、pH 7.3、酶解时间4.0 h、酶解温度50.3 ℃，进行验证实验(n=3)，得实测提取率为78.39%，与预测值相差0.66%，证明用所建模型预测大黄鱼肝油提取率是准确可行的。

2.3 大黄鱼肝油的品质分析

由表4可知，酶法提取的大黄鱼肝油提取率为(78.39±1.91)%，比淡碱法提高了1.8倍。酶法提取的大黄鱼肝油呈黄色、较澄清，气味具有鱼肝油的腥味，而淡碱法提取的大黄鱼肝油呈深黄色、且有少量浑浊，气味具有鱼肝油的腥味，稍有鱼肝油的酸败味，这是因为淡碱法在水解过程中温度过高，部分不饱和脂肪酸氧化[24]，最终导致大黄鱼肝油品质下降。酶法提取的大黄鱼肝油酸价低于淡碱法的，碘价虽略高于淡碱法的但仍符合SC/T 3502—2016。

表4 酶法与淡碱法提取的大黄鱼肝油品质比较†

2.4 大黄鱼肝油的脂肪酸组成

由表5可知，酶解法与淡碱法提取的大黄鱼肝油中脂肪酸组成差异极显著(P<0.01)，酶解法鱼油中共检出13种脂肪酸，其中饱和脂肪酸5种，单不饱和脂肪酸3种，多不饱和脂肪酸5种。淡碱法鱼油中共检出8种脂肪酸，其中饱和脂肪酸3种，单不饱和脂肪酸2种，多不饱和脂肪酸3种。淡碱法中总饱和脂肪酸含量为30.35 g/100 g，高于酶解法的(19.71 g/100 g)；酶解法鱼油中单不饱和脂肪酸含量为62.63 g/100 g，淡碱法的为51.97 g/100 g，二者具有极显著性差异(P<0.01)；两种制备方法的多不饱和脂肪酸总量相差相对较小。

表5 大黄鱼肝油的脂肪酸组成†

2.4.1 饱和脂肪酸 两种方法制备的大黄鱼肝油中，C18:0(硬脂酸)与C16:0(棕榈酸)含量有较大差异，淡碱法鱼油的硬脂酸和棕榈酸分别为酶法的1.6倍。研究[25-26]表明，硬脂酸可以降低胆固醇吸收，从而降低血清和肝脏中的胆固醇水平，对人体起一定保护作用。棕榈酸可以降低血清中胆固醇含量，是心脏运动期间合成的首选脂肪酸[27]。淡碱法鱼油的饱和脂肪酸含量虽略高于酶解法的，但其饱和脂肪酸种类少于酶法的，其中C14:0(肉蔻酸)与C17:0(珍珠酸)在淡碱法中未检出。

2.4.2 单不饱和脂肪酸 酶法鱼油的单不饱和脂肪酸含量更为丰富，高于鳗鱼肝油的[28]。其中C17:1在淡碱法与鳗鱼肝油中未检出。酶法鱼油的C16:1(棕榈油酸)含量较多，为淡碱法的1.7倍，其C18:1(油酸)含量也相对较多，说明酶法提取对鱼肝中单不饱和脂肪酸的破坏较小，而油酸和棕榈油酸的结合对缓解血栓形成、降低心律失常和中风风险、降低低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平和提高高密度脂蛋白(HDL)浓度具有积极作用，这些作用有助于降低血压和增加动脉血管舒张[29-30]。

2.4.3 多不饱和脂肪酸 酶法鱼油中多不饱和脂肪酸种类高于淡碱法的，其含量高于鳗鱼肝油中的[28]。酶法鱼油中含有少量C20:3(花生三烯酸)和C20:4(n-6)(花生四烯酸)，而淡碱法中未检出。C18:2(n-6)(亚油酸)为含量最高的多不饱和脂肪酸，酶法、淡碱法鱼油中亚油酸含量分别为(12.64±0.26)，(14.71±0.61) g/100 g。亚油酸是一种必需脂肪酸，为磷脂的重要组成部分；又是合成前列腺素的前体，有利于皮肤修复，对促进生长发育、视力和肝肾功能发挥重要作用。临床和流行病学研究[31]表明，EPA和DHA仅存在于鱼类和海产品中，并且在预防人类冠状动脉疾病中起着极其重要的作用。

3 结论

试验表明，大黄鱼肝油的最佳酶解工艺为中性蛋白酶添加量2.5%、料液比1∶2 (g/mL)、pH 7.3、酶解时间4.0 h、酶解温度50.3 ℃，此工艺条件下提取率达78.39%，比一般的淡碱法提高了1.8倍，且鱼肝油澄清，酸价仅为(5.83±0.15) mg/g，碘价为(142.65±0.22) mg/100 g，其脂肪酸组成更为丰富，共检出13种脂肪酸，其中饱和脂肪酸5种，单不饱和脂肪酸3种，多不饱和脂肪酸5种。而淡碱法鱼肝油中仅检测到8种脂肪酸，且以饱和脂肪酸为主，因此，酶解法的大黄鱼肝油提取率及脂肪酸组成均优于传统淡碱法。后续可进一步制备大黄鱼肝活性肽。