玉米eIF5A基因克隆及生物信息学分析

单莉杰， 李 壮， 郑大浩， 吴委林

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

玉米是世界上分布最广的作物之一，2015年我国玉米种植面积达3 811.93万hm2，产量为2.25亿t，是我国第1大粮食作物[1-2]。玉米中除淀粉、蛋白质、脂肪外，还含有钙、谷胱甘肽、核黄素和胡萝卜素等多种营养物质，有极高的营养价值[3]。玉米弯孢菌叶斑病是继玉米大斑病、小斑病的一种新型病害，主要危害植株叶片、叶鞘和苞叶，在玉米各生育期内均可发生，一般减产20%～30%，严重可减产50%以上，甚至绝收[4-5]，严重影响玉米产量与质量。

弯孢菌(Curvularialunata)通过分泌聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)和纤维素酶(Cx)等多种细胞壁降解酶，破坏植物的细胞壁、细胞膜等防御组织，使植株叶片产生圆形或椭圆形病斑，造成叶片大面积坏死[6]。植物在遭受弯孢菌侵染后，体内可产生苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)等多种防御酶。其中，PAL催化苯丙氨酸脱氨基后产生肉桂酸，最终转化为木质素；POD催化脂肪族芳香胺和酚类氧化，是木质素合成的关键酶[7]。而木质素是植物木质部细胞壁的主要成分，Liu等[8]研究发现，eIF5A基因在木质部形成过程中起重要作用，还可直接参与病原真菌的侵染[9]，延缓叶片衰老[10]，提高氧化胁迫抗性[11]。因此，推测eIF5A基因与玉米抗弯孢菌侵染密切相关。

该研究以玉米弯孢菌抗性自交系Mo17和感性自交系黄早四为材料，分别克隆出Mo17和黄早四的eIF5A基因，并通过生物信息学手段比较分析两者之间的序列与蛋白质构象差异，为玉米eIF5A基因对弯孢菌抗性的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取玉米弯孢菌抗性自交系Mo17和感性自交系黄早四种子，播种在农学院教学实验基地，待玉米长出完整的3片叶时，选取顶部第3片叶为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取与cDNA合成

取0.1 g新鲜玉米叶片，加入液氮充分研磨，利用RNA simple 总RNA试剂盒，按照试剂盒说明书操作，随后进行反转录，反转录体系(20 μL)为：5×FastKing-RT SuperMIx 4 μL，Total RNA 50 ng～2 μg，RNase-Free ddH2O补足到20 μL。反应程序为42 ℃ 15 min，85 ℃ 3 min。反转录得到的cDNA在-20 ℃冷冻保存，备用。

1.2.2 基因克隆与测序

通过以玉米标准基因组数据库(http://www.maizegdb.org)上的eIF5A基因的cDNA序列，以此序列为基础利用Primer Premier 6.0S设计引物，其中正向引物为eIF5A F58:5’-GGATCGCCATGTCGGACT-3’,反向引物为eIF5A R745:5’-GGGCATAAAAGCATAGAAAATAC-3’。

PCR扩增参照Promega PCR系试剂盒说明书。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃最终延伸300 s。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，与pMD19-T进行连接，再导入到感受态大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄青霉素、IPTG、X-Gal的培养基上进行培养，利用蓝白斑筛选，选择阳性菌落(白色)。酶切验证正确后，送到上海生工公司测序。

1.2.3 序列同源性分析

利用DNAStar和GenDoc2.0软件对目标氨基酸序列进行同源性比对分析和序列分析，在NCBI下载禾本科eIF5A蛋白序列并利用MEGA 7软件采用最大似然法构建进化树。

1.2.4 生物信息学分析

目标DNA序列编码的蛋白质序列分析，利用NCBI在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对蛋白质序列进行同源比对；利用在线工具ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)和ProtScale(http://ca.expasy.org/tools/protscale.html)对蛋白质序列进行理化性质及亲疏水性等一级结构分析；利用在线工具TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对蛋白质跨膜区分析；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测蛋白质二级结构；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)预测蛋白质三级结构；利用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点。

2 结果与分析

2.1 eIF5A基因序列分析

从玉米抗病自交系Mo17和感病自交系黄早四中成功克隆并分离得到完整的含有目的基因的cDNA片段，在NCBI网站上进行Blast比对，发现从Mo17中克隆得到的eIF5A基因序列与已公布的eIF5A基因序列(登录号为NM_001112136.1)相似性达100%。证实所得序列为玉米eIF5A基因。从Mo17中分离的片段长度为688 bp，从黄早四分离的片段长度为690 bp，2种自交系均具有完整的开放阅读框(图1)，均编码160个氨基酸(图2)。进一步序列比对发现二者碱基序列存在32处突变，其中，ORF内发生2处替换突变；3’端发生28处替换突变和2处插入突变。蛋白质序列存在1个区别，即第146的M蛋氨酸变为I异亮氨酸。

图1 玉米自交系Mo17和黄早四的基因序列比较

图2 玉米自交系Mo17和黄早四编码蛋白质比较

2.2 目标序列的生物信息学分析

2.2.1 蛋白质理化性质分析

利用在线工具(http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html)、ProtParam、ProtScale和TMHMM Server v.2.0对蛋白质信号肽(图3)、亲疏水性和跨膜结构(图4)进行分析比对[12]。结果显示，抗病材料Mo17和感病材料黄早四所含有疏水性氨基酸与亲水性氨基酸残基数相同，其中，疏水性氨基酸残基54个，亲水性氨基酸残基106个，但异亮氨酸(I)和甲硫氨酸(M)在Mo17中所占比率分别为6.2%和1.2%，在黄早四中所占比率分别为6.9%和0.6%。eIF5A基因编码氨基酸在Mo17和黄早四中相对分子量分别为17.50 KD和17.48 KD，总元素数量分别为2 442和2 444，除N元素和O元素数量相同外，其余C、H、S 3种元素在数量上均有差异，分别为760、1 215、6和761、121 7、5。理论等电点(PI)均为5.61，有25个负电荷残基(Asp + Glu)和19个正电荷残基(Arg+Lys)，总平均亲疏水性分别为-0.487和-0.471，不稳定系数(Ⅱ)为30.31(<40)，所以该基因编码的蛋白质为推断稳定的亲水性蛋白。该蛋白在Mo17和黄早四2种材料中均无信号肽，且无跨膜区域结构，说明该蛋白为非跨膜蛋白。

图3 Mo17和黄早四的eIF5A信号肽预测

图4 Mo17和黄早四的eIF5A跨膜结构分析

2.2.2 蛋白质二级、三级结构预测

利用在线软件SOPMA软件对蛋白质二级结构进行预测得到以下信息(表1)，该蛋白在Mo17和黄早四中均由α螺旋、延伸链、β转角、无规则卷曲2部分构成，延伸链数目相同，均为36，无规则卷曲在氨基酸总数中所占比例较大，分别为49.38%和46.88%，β转角为7.50%和6.25%，所占比率最小。图5更为直观地表明eIF5A蛋白在2种材料中二级结构存在的差异。

表1 Mo17和黄早四eIF5A蛋白二级结构差异

注：A为α-螺旋；B为无规则卷曲；C为β转角；D为延伸链

通过在线工具SWISS-MODEL建立蛋白质的三维结构模型[13]，预测蛋白质的三级结构(图6)，得到下面的三维结构立体图，由于Mo17和黄早四在碱基序列上的差异，导致蛋白质三级结构有所不同。

图6 Mo17和黄早四eIF5A蛋白质的三级结构差异

2.2.3eIF5A蛋白同源性分析及进化树

在NCBI在线工具上下载与eIF5A相似性高的序列并利用MEGA 7软件构建玉米(Mo17和Huangzao4)、高粱(XP_002463132.2)、黍(XP_025800571.1)、粟米(RLM84934.1)、谷子(XP_004958204.1)、疣粒野生稻(KAF0907150.1)、粗山羊草(ABB29986.1)、拟鹅观草(ABB90157.1)、长穗偃麦草(ABB90158.1)、光稃旱麦草(ABB90159.1)、节节麦(ABB90160.1)、普通小麦(AAZ95172.1)、黑麦(ABB90161.1)、新麦草(ABB90162.1)、簇毛麦(ABB90164.1)的进化树(图7)。结果表明，玉米与其他禾本科植物进化树分为3支，玉米与疣粒野生稻、谷子、黍、粟米、高粱为1支，光稃旱麦草、普通小麦、粗山羊草、节节麦、黑麦、长穗偃麦草、簇毛麦为第1支，拟鹅观草、新麦草为第2支，其中，玉米与高粱的亲缘关系最近。

图7 eIF5A与其他植物氨基酸序列进化树

2.2.4 磷酸化位点分析

用在线工具NetPhos3.1预测磷酸化位点(图8，9)，可观察到Mo17和黄早四的eIF5A磷酸化位点均有15个，且磷酸化位点一致，其中，Ser有8个、Thr有6个、Tyr有1个。Ser磷酸化位点为Ser 2、Ser 4、Ser 11、Ser 18、Ser 47、Ser 79、Ser 108、Ser 134；Thr磷酸化位点为Thr 20、Thr 27、Thr 48、Thr51、Thr 107、Thr 112；Tyr磷酸化位点为Tyr 92。

图8 Mo17 eIF5A蛋白的磷酸化位点

图9 黄早四eIF5A蛋白的磷酸化位点

2.2.5eIF5A蛋白的功能预测

利用NCBI在线工具对eIF5A蛋白进行功能结构域预测[14]，结果显示Mo17和黄早四eIF5A基因编码的蛋白质均有1个保守结构域，该结构域位于第2～160位氨基酸之间，属于PLN103107超级家族(图10，11)。

图10 Mo17 eIF5A蛋白的功能

图11 黄早四eIF5A蛋白的功能

3 讨论与结论

eIF5A基因在动植物和真菌体内普遍存在，具有促进细胞增殖、调控细胞衰老、抵御外界生物胁迫及非生物胁迫的功能[15-19]。进一步研究发现，eIF5A基因在NaCl、NaHCO3等非生物胁迫下可增强POD、SOD等防御酶活性，提高叶绿素含量[20-21]。而植物在遭受弯孢菌侵染后，植株通过叶片坏死，体内防御酶活性升高，有效清除活性氧，使植株免受活性氧的伤害。揭示了eIF5A基因在弯孢菌抗性中发挥重要作用，推测eIF5A基因通过提高多种防御酶活性提高植物的抗病能力。该研究选用玉米弯孢菌抗性自交系Mo17和感性自交系黄早四为材料，克隆出的玉米eIF5A基因片段分别为688和690 bp，在ORF内有2处碱基替换突变，导致蛋白质的三维构象发生改变，同时3’UTR存在多处碱基突变，所编码的蛋白质为非跨膜稳定的亲水性蛋白，含有15个磷酸化位点，与其他禾本科植物同源序列比对发现，氨基酸序列的一致性较高，说明eIF5A蛋白在禾本科植物中功能较为保守。

该研究中，Mo17与黄早四的eIF5A基因在3’UTR存在多处碱基突变，结合前期试验发现，抗病自交系鲁原92和78599-1受弯孢菌侵染后eIF5A蛋白表达量升高，而感病自交系E28和黄早四的eIF5A蛋白表达量没有变化[22]，暗示了可能存在相关miRNA通过调控eIF5A基因的表达影响玉米抵抗弯孢菌侵害的作用；而ORF内的2处碱基替换突变导致蛋白质的三维构象发生改变是否会影响玉米对弯孢菌的抗性还需进一步深入研究。