血浆外泌体源性miRNA-188-5p与miRNA-4741在子宫内膜异位症中诊断价值

王礼贤，胡月阳

子宫内膜异位症(endometriosis，EMT)是一种常见的妇科病，临床表现为痛经、不孕和盆腔包块等，在育龄期女性中发病率为10%～15%，且呈逐年上升趋势，由于缺乏特异性的诊断标志物，确诊时间平均延迟6～7年[1]。腹腔镜检查虽为诊断的“金标准”，但其为有创性检查且费用昂贵并不能被患者广泛接受，因此，寻找特异性强和敏感性高的非侵入性诊断标记物在EMT的研究中尤为重要。近年来，有研究认为微小RNA(microRNA，miRNA)具备成为许多疾病潜在生物标志物的可能性[2]。在此之前作者已对EMT患者和正常对照女性子宫内膜间质细胞的外泌体源性miRNA进行芯片分析。以此为基础，该研究拟采用RT-qPCR技术检测EMT患者与正常对照女性血浆外泌体源性miRNA-188-5p与miRNA-4741的表达水平，并通过ROC曲线分析二者在EMT中诊断价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2017年1月～2018年4月就诊于河北医科大学第四医院妇科的经病理确诊为EMT的患者50例，年龄26～39(32.71±5.60)岁，取其血浆标本为病例组；另选取同时期健康体检无异常的育龄期妇女50例，年龄28～38(33.68±4.22)岁，取其血浆标本为对照组；所有入组者既往月经规律，3个月内未服用过激素类药物，亦无其他身体疾病。所有参与者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1标本采集和外泌体提取 使用含EDTA-K2的真空采血管收集全部受试者的血液标本，离心5 min (3 000 r/min)分离血浆，使用外泌体提取试剂盒(美国Invitrogen公司)提取血浆标本中的外泌体；使用miRcute亲和柱(北京天根生化科技公司)提取和纯化外泌体内的miRNA，上述操作严格按说明书操作。将纯化好的miRNA溶解于RNase-Free dd H2O 10 μl(北京天根生化科技公司)，保存于液氮中供试验用。

1.2.2实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR) 采用逆转录试剂盒(美国promega公司)对提取的RNA逆转录呈cDNA。反应条件为：37 ℃、60 min，65 ℃、5 s。PCR反应体系为：5 μl SYBR green MIX(日本Takara公司)，5 μl cDNA，去RNA水3 μl，靶基因上、下游引物各1 μl。反应程序：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，72 ℃、10 s；共40个循环。仪器采用Prism7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物详见表1。每份标本设置3个复孔。以内参U6为miRNA相对定量参照基因。对每个检测目标基因设定相同的循环阈值(cycle threshold，CT值)极限和截点。计算miRNA表达量计算公式：2-ΔΔCT来比较组间差异，其中ΔCT=CT(目的基因)-CT(内参基因)。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.2.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 电泳设备：电泳仪和电泳槽(北京市六一仪器厂)。采用2 g琼脂糖(西班牙进口分装)、1×TAE缓冲液100 ml 和EB溶液(北京鼎盛生物技术公司)7 μl制备1.5%琼脂糖凝胶。电泳槽内加入1×TAE电泳液600 ml。加样，DNA Marker，样品5 μl，设置空白对照GAPDH。电压120 V，电流60 mA，电泳20 min，然后凝胶成像仪(英国Syngene公司)下成像，摄影。

1.3 统计学处理根据前期芯片结果，采用R2.15.0软件，对两组外泌体源性miRNA-188-5p与miRNA-4741表达水平进行聚类分析。采用SPSS 21.0软件对所有数据进行统计学分析，数据呈非正态分布，用中位数(四分位数间距)来表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验，截断值的确定采用受试者工作曲线(receiver operator characteristic curve, ROC曲线)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般资料比较病例组和对照组年龄、初潮年龄、月经周期、胎产次和体质指数(body mass index，BMI)比较差异均无统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 病例组与对照组研究对象的一般特征

2.2 外泌体源性miRNA-188-5p与miRNA-4741的表达差异首先，根据前期芯片结果，采用R2.15.0软件，对两组中外泌体源性miRNA-188-5p与miRNA-4741的表达水平进行聚类分析，见图1A。如图所示，列表示组织样本，行表示表达水平，用红色和绿色分别表示高表达和低表达，黑色介于二者之间。根据组织样本类别不同自动发生聚集，10个样本自然分为两组，E1-5代表病例组，N1-5代表对照组，组内5个样本一致性较高，从图中可看出miRNA-188-5p与miRNA-4741表达水平在两组间比较差异较大：病例组中大部分呈现绿色，即表达降低；对照组中大部分呈现红色，即表达升高。其次，采用RT-PCR技术检测病例组和对照组中miRNA-188-5p与miRNA-4741表达水平，见图1B。如图所示，E1-3代表病例组，N1-3代表对照组，病例组中miRNA-188-5p与miRNA-4741表达水平较对照组低。

图1 两组中血浆外泌体源性miRNA-188-5p与miR-4741表达差异

2.3 外泌体的形态学特点采用外泌体提取试剂盒提取出外泌体后，用PBS稀释，经负染后于透射电镜下观察，可见大小不均一的圆形或类圆形透亮区，此为囊泡状的外泌体，其外层为脂质包裹，直径在30～200 nm之间(图2)。

图2 透射电镜下血浆外泌体的形态

2.4 两组血浆外泌体源性miRNA-188-5p与miRNA-4741表达的比较采用RT-qPCR技术检测两组血浆中外泌体miRNA-188-5p与miRNA-4741表达水平。与对照组中miRNA-188-5p的表达水平0.537(0.463～0.609)相比，病例组中miRNA-188-5p的表达水平0.023(0.010～0.029)明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组中miRNA-4741的表达水平0.628(0.537～0.714)相比，病例组中miRNA-4741的表达水平0.047(0.015～0.089)明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 血浆外泌体源性miRNA-188-5p与miRNA-4741在EMT中的诊断价值通过ROC曲线分析，结果显示血浆外泌体源性miRNA-188-5p诊断EMT的截断值为0.025，曲线下面积(area under curve，AUC)为0.875(95% CI：0.746～0.933)，敏感性度77.6%，特异度为83.5%；血浆外泌体源性miRNA-4741诊断EMT的截断值为0.056，AUC为0.907(95%CI：0.824～0.961)，敏感度为84.5%，特异性度91.2%；二者联和诊断EMT的截断值为0.047，AUC为0.916(95%CI：0.835～0.963)，敏感度为87.1%，特异性度93.8%，见图3和表3。

图3 血浆外泌体miRNA-188-5p与miRNA-4741诊断EMT的ROC曲线

表3 血浆外泌体miRNA-188-5p与miR-4741诊断EMT的ROC曲线参数

3 讨论

近年来，许多研究认为miRNA可通过调节细胞分裂、分化和凋亡以及细胞间的信号传导，参与调节EMT的促进经血逆流、炎症发生和血管生成等多种病理过程，多种循环miRNA被认为具有EMT组织特异性[3-4]。Hunter et al[5]发现血浆中miRNA主要来源于外泌体，外泌体源性miRNA因受外泌体双层膜结构的保护，使其免受RNA酶的降解，具有较好的稳定性，提高其作为疾病生物标志物的潜力。许多研究[6]表明外泌体源性miRNA与多种疾病的发生和发展密切相关，例如卵巢肿瘤、肺腺癌和乳腺癌等。EMT虽为一种良性疾病，却具有侵袭、复发等恶性肿瘤的生物学行为。并且，外泌体在血浆中具有很高的浓度，且血浆样本具有采集容易、可重复获得以及对患者创伤小的特点，因此，血浆外泌体源性miRNA具备了成为EMT的非侵入性生物标志物的条件[1]。

国内外对于EMT中外泌体和外泌体源性miRNA的研究报道甚少，目前尚处于起步阶段，本研究是国内首次对EMT患者血浆外泌体源性miRNA-188-5p与miRNA-4741表达水平进行检测，结果发现与对照组相比，病例组中二者的表达水平降低，差异有统计学意义，此结果也与我们前期芯片结果一致，验证了芯片结果的真实性和可靠性。目前，国内外学者对于miRNA-188-5p与miR-4741的研究也较少，Li et al[7]发现miR-188-5p作为抑癌基因，在胶质瘤中miRNA-188-5p过表达，可以抑制β-catenin表达，从而抑制胶质瘤细胞增殖、细胞周期的转换，起到促进细胞凋亡的作用。虽然到目前为止EMT的发病机制尚不清楚，但很多研究[8]表明EMT患者的在位内膜和异位内膜细胞的增殖率增加，凋亡率减少。因此，推测在EMT患者中miRNA-188-5p表达水平降低，可能通过促进内膜细胞的增殖，减少内膜细胞的凋亡，从而在EMT的发生中发挥了一定的作用。对于miR-4741的研究，Liu et al[9]在寻找预测肝细胞癌肝动脉栓塞术预后的生物标志物的研究中，首先采用miRNA Profiling Chips筛选出包含miR-4741在内的19个差异表达miRNA，随后采用RT-qPCR技术检测miR-4741表达水平，发现其存在差异表达，到目前为止虽还未发现其具体功能，但研究认为血液循环中miR-4741作为可以预测肝细胞癌肝动脉栓塞术预后的一个候选生物标志物。就本研究而言，在前期采用芯片技术，筛选出与正常女性相比，EMT中多个具有差异表达的外泌体源性miRNA，再采用RT-qPCR技术发现病例组中miR-4741 表达低于对照组，从而推测血浆外泌体源性miRNA-4741可以作为检测卵巢子宫内膜异位症的一个生物标志物。

目前，临床上对于EMT的术前诊断主要依靠超声和血清糖类抗原125(cancer antigen-125,CA125)检查，超声检查对于早期、不典型和特殊部位的EMT诊断率并不高，存在一定的局限性；而血清CA125是糖蛋白性的肿瘤相关抗原，虽然作为诊断EMT常规的实验室检查已在临床上应用多年，但其灵敏度和特异度并不是特别高，发生卵巢癌或上皮性肿瘤时CA125也会升高。周赞华 等[10]认为CA125诊断EMT的敏感度为74.4%，特异度为72.7%；汤礼宾 等[11]认为CA125诊断EMT的敏感度为66.3%，特异度为85.5%。而本研究显示血浆外泌体源性miRNA-188-5p、miRNA-4741以及二者联合起来诊断EMT的敏感度分别为77.6%、84.5%和87.1%，特异度分别为83.5%、91.2%和93.8%，与血清CA125相比具有较高的诊断效能。综上，血浆外泌体源性miRNA-188-5p与miRNA-4741可作为诊断EMT潜在的生物学标志物，为今后EMT非创伤性检查的生物标志物的寻找和鉴定提供了新方向。