中药橘核质量标准研究

赵胜斌

(汝州市人民医院药械科，河南 汝州 467500)

橘核为芸香科植物橘及其栽培变种干燥成熟种子，在我国有悠久的药用历史，早在五代时期的本草专著《日华子本草》中就有其应用的相关记载[1]。该药物味苦，平，无毒，主要用于治疗膀胱气痛、肾冷等，现代药理学研究结果显示橘核具有较强的镇痛抗炎、抗肿瘤等作用[2-3]。对于橘核的质量标准从《中国药典》1963年版至2015年版均有相关的记载，但目前橘核的质量标准仍以性状及显微鉴别为主，对其薄层色谱鉴别及含量测定等现代鉴别手段并无相关要求，已不能适应目前的用药要求，因此有必要对其质量标准进行提高以进一步提高质量控制水平，规范其质量[4]。经过多年研究发现，橘核内生物活性成分以柠檬苦素、诺米林、黄柏酮为主，本研究拟采用高效液相色谱法对橘核中上述成分进行定量分析，以期为橘核的质量控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 采用美国安捷伦公司生产的1200型高效液相色谱仪(检测器：DAD二极管阵列检测器，色谱工作站为安捷伦公司专用工作站，四元梯度泵、柱温箱、自动进样器)。AUW220D型十万分之一天平(日本岛津公司)；BP121S万分之一天平(德国赛多利斯公司)。

1.2 试药 柠檬苦素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110800-201707)；诺米林(赫澎生物上海科技有限公司，批号:1063-77-0)；黄柏酮(中国食品药品检定研究院，批号：111923-201604)；乙腈、甲醇为色谱纯购自德国默克化工技术有限公司，试验用水为自制纯化水。石油醚(60～90 ℃)、乙醚、乙醇、甲醇为分析纯均购自天津四友精细化学品有限公司。橘核分别购自安徽亳州药材市场、广州清平药材市场、广西玉林药材市场及河北安国药材市场，均经汝州市药品检验所弓西方副主任中药师鉴定为芸香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培变种的干燥成熟种子，详见表1。

表1 橘核药材来源

1.3 色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18(4.5 mm×250 mm,5 μm)，流动相乙腈-水(64∶36)等度洗脱，柱温：30 ℃，检测波长：210 nm，流速：1.0 mL·min-1，进样量：10 μL。

1.4 溶液的制备

1.4.1 混合对照品溶液 精密称取柠檬苦素、诺米林、黄柏酮对照品适量，分别置10 mL量瓶，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到含柠檬苦素、诺米林、黄柏酮对照品分别为0.99、1.01、0.98 mg·L-1的对照品储备液，分别精密量取上述对照品储备液各2 mL置入同一10 mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，得到柠檬苦素、诺米林、黄柏酮浓度分别为0.198、0.202、0.196 mg·L-1的混合对照品溶液。

1.4.2 供试品溶液的制备 精密称取本品粉末0.5 g(过三号筛)，精密加入无水乙醇25 mL，超声提取30 min，滤过、滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，置10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，得到供试品溶液。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线的绘制 精密吸取“1.4.1”项下混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL，分别按“1.3”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以峰面积为Y轴，对照品进样量为X轴进行线性回归，得到柠檬苦素、诺米林、黄柏酮回归方程，结果见表2。

表2 各对照品回归方程及相关系数

2.1.2 精密度试验 精密吸取“1.4.1”项下混合对照品溶液10 μL，按“1.3”项下色谱条件连续进行6次测定，记录柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积，计算相对标准偏差(RSD)，柠檬苦素、诺米林、黄柏酮分别为0.65%、0.62%、0.37%。

2.1.3 重复性试验 取6份3号样品粉末，每份约0.5 g，精密称定，按“1.4.2”项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，以“1.3”项下条件进行含量测定，记录柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积，计算RSD值分别为1.26%、1.09%和1.33%。

2.1.4 稳定性试验 取3号样品粉末约0.5 g，精密称定，按“1.4.2”项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，在配置后0、2、4、8、12、24 h后分别按“1.3”项下色谱条件进行含量测定，记录柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积，计算RSD值分别为0.89%、1.27%、1.03%，提示24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.1.5 定量限与检测限考察 取“1.4.1”项下混合对照品溶液适量进行倍比稀释，再“1.3”项下色谱条件连续进行6次进样检测，记录峰记录柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积。分别对定量限及检测限进行计算，以信噪比为10∶1时为定量限，信噪比为3∶1时为检测限，柠檬苦素、诺米林、黄柏酮定量限分别为1.07、1.34、1.48 ng；柠檬苦素、诺米林、黄柏酮检测限分别为0.39、0.22、0.35 ng。

2.1.6 加样回收率试验 取已知含量的供试品(3号样品)6份，各0.25 g，精密称定，分别加入一定量的柠檬苦素、诺米林、黄柏酮对照品，分别按“1.4.2”项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，以“1.3”项下条件进行含量测定，计算回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果

2.2 样品含量测定结果 取11批样品，“1.4.2”项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，以“1.3”项下条件进行含量测定，分别计算各批次柠檬苦素、诺米林、黄柏酮质量分数(以干燥品计)，结果见表4。11批样品中柠檬苦素、诺米林、黄柏酮平均质量分数分别为0.702%、0.412%、0.072%，以均值-20%为其限度标准，暂定为橘核中柠檬苦素、诺米林、黄柏酮含量不得低于0.56%、0.33%、0.06%。

表4 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 供试品制备工艺的考察 制备工艺方面因橘核为种子类药材，含有大量的脂肪油，因此考虑先对药材进行脱脂处理，本研究先后对不脱脂无水乙醇超声提取30 min、以石油醚(60～90 ℃)超声脱脂处理30 min后弃去石油醚液再乙醇超声30 min及乙醚超声脱脂处理30 min后弃去乙醚液再乙醇超声30 min，发现3种提取方法所提取的柠檬苦素、诺米林、黄柏酮得率RSD在3%以内，加上节能、减排的考虑，在提取前不做脱脂处理[5-6]。在提取方法上，本研究考察了超声、回流及高速匀浆3种提取方法，发现超声与回流提取所提取的柠檬苦素、诺米林、黄柏酮得率RSD在3%以内，故选择超声操作更为简便，另外高速匀浆法虽然目标物得率有所提高，但因该方法所使用的高速匀浆仪目前国内实验室普及率不高，考虑到标准的普适性暂未将该提取方法纳入本标准中，将来待该仪器在国内实验室普及率较高时可考虑使用高速匀浆法进行提取，该方法提取效率高、操作时间短，具有较明显的优势[7]。另外本研究还对提取时间、提取溶剂及料液比进行考察，提取时间方面考察了提取10、20、30、40、60 min，发现在提取30 min后各目标成分含量并无明显上升，因此选择30 min作为提取时间。提取溶剂方面考察了二氯甲烷、无水乙醇、甲醇，发现无水乙醇提取效率高且毒性小，料液比方面在1∶50时提取效率最高，随后料液比升高目标物得率并无明显上升。

3.2 检测波长的确定 取柠檬苦素、诺米林、黄柏酮对照品溶液，以DAD检测器进行全波长扫描结果发现柠檬苦素、诺米林、黄柏酮最大吸收峰波长分别为210、211、214 nm，分别选择上述波长下色谱图分析发现在210 nm时各色谱峰分离效果最佳，理论塔板数较高，故选作本次研究的测定波长。

3.3 流动相的选择 流动相方面在查阅文献[8-9]的基础上本研究先对甲醇-水(62∶38)、乙腈-水(62∶38)进行对比发现乙腈-水系统色谱峰峰形更尖锐，理论塔板数更高，故选择该系统进行优化，在乙腈-水(64∶36)时分离效果最佳，对照品及供试品均可在15 min完成检测。另外本研究还对不同品牌液相色谱仪及色谱柱进行分析，结果显示具有较高的重现性。

橘核具有理气、散结、止痛的功效，临床上常用于治疗疝气疼痛、睾丸疼痛等疾病，临床应用较多[10]。但目前现行的《中国药典》2015年版中橘核的指标标准仅收载性状及显微鉴别方法，对其含量并未作要求。本研究开发的中药橘核中柠檬苦素、诺米林、黄柏酮高效液相色谱含量测定方法，操作简便，重复性高，稳定性、精密性良好，可用于提高橘核质量评价。