阿胶口服液中粗多糖含量测定方法的研究

刘春霖，吴晓云，谢强胜，高天阳，董蓬

(山东省食品药品检验研究院，山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，山东 济南 250101)

阿胶为马科动物驴(EquusasinmL.)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。它是我国传统的名贵补血中药，具有补血滋阴，润燥，止血，增强体质，增强免疫力等功效[1-3]。本次研究的阿胶口服液是以阿胶为主要原料，添加熟地黄、党参、枸杞子、黄芪等中药材，经提取、浓缩、配制、灌装等主要工艺制成的产品，具有增强免疫力的保健功能。上述添加的中药材均含有多糖类成分，文献研究报道具有免疫调节、抗氧化、抗疲劳的作用[4-8]。近年来，很多学者对不同中药材的粗多糖含量进行了研究[9-10]，但是针对阿胶口服液中粗多糖的研究还比较少。本研究采用沉淀蛋白质等前处理方法，使样品中相对分子质量大于10 000的高分子物质与阿胶分离，然后在体积分数80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖分离，用苯酚-硫酸反应，其呈色强度与溶液中糖的浓度成正比，在485 nm波长下比色测定粗多糖(以葡聚糖计)含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Mettler Toledo Ms十万分之一电子天平(德国梅特勒公司)；恒温水浴锅(上海树立仪器仪表有限公司)；TDZ5-WS离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；XK96-B涡旋混合器(姜堰市新康医疗器械有限公司)；TU-1901紫外分光光度计(北京普析通用公司)。

1.2 试剂试药 乙酸锌、亚铁氰化钾、苯酚、无水乙醇、浓硫酸，分析纯；水为去离子水；乙酸锌溶液：称取乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]21.9 g，加冰乙酸3 mL，加水溶解并稀释至100 mL；亚铁氰化钾溶液：称取亚铁氰化钾{K4[Fe(CN)6]·3H2O}10.6 g，加水溶解并稀释至100 mL；80%(V/V)乙醇溶液：20 mL水中加入无水乙醇80 mL，混匀；苯酚溶液(50 g·L-1)：称取精制苯酚5.0 g，加水溶解并稀释至100 mL，混匀，备用。

葡聚糖标准品：相对分子量500 000，批号：BCBN7863V，购自Sigma公司。

葡聚糖标准储备液：准确称取干燥至恒重的葡聚糖对照品0.5 g，加水溶解，并定容至50 mL，混匀，置冰箱中保存。此溶液1 mL含葡聚糖10 mg。

葡聚糖标准使用液：吸取葡聚糖标准储备液1.00 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存。此溶液1 mL含葡聚糖100 μg。

阿胶：某阿胶制品公司提供，和样品来源为同一家公司。

样品：某阿胶制品公司提供，3批编号分别为1、2、3。

2 方法与结果

2.1 标准曲线系列溶液制备 精密吸取葡聚糖标准使用液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60 mL(相当于葡聚糖0、10、20、40、60、80、100、120、140、160 μg)，分别置于25 mL比色管中，准确加水补充至2.0 mL，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，在旋转混合器上混匀，小心加入浓硫酸10.0 mL，于旋转混合器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2 min，冷却后用分光光度计在485 nm波长处，以试剂空白为试验参比，1 cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖浓度(μg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2 样品溶液的制备

2.2.1 试样沉淀蛋白质处理 取混合均匀的试样15 mL，置250 mL容量瓶中，加水50 mL，缓慢加入乙酸锌溶液5 mL和亚铁氰化钾溶液5 mL，加水至刻度，混匀，静置30 min，用干燥滤纸过滤，取续滤液备用。

2.2.2 沉淀粗多糖 准确吸取上一步滤液5 mL，置于50 mL离心管中，加入无水乙醇20 mL，混匀，置4 ℃冰箱中冷藏过夜，以4 000 rpm离心30 min，弃去上清液，残渣用体积分数80%乙醇溶液数毫升洗涤，以4 000 rpm离心15 min，离心后弃上清液，反复操作2次，残渣用水溶解并定容至25 mL，混匀，此溶液为样品测定液。

2.2.3 样品测定 分别吸取2.0 mL样品测定液置25 mL比色管中，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，混匀，加入浓硫酸10.0 mL，混匀，密塞，沸水浴加热2 min，立即冷却至室温得待测溶液。在485 nm波长处测定吸光度值。从标准曲线上查出葡聚糖的质量，计算，即得样品粗多糖含量。

2.3 标准曲线回归方程线性范围 取标准曲线系列溶液进仪器测定，结果表明葡聚糖的标准溶液在10.8～172.8 μg范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.999 9，结果见表1。

表1 线性试验结果

2.4 取样量考察 分别量取同一批号的样品5、10、15、25 mL各2份，按上述样品溶液的制备方法制得待测溶液，测得葡聚糖含量分别为244.6、253.1、285.7、280.9 mg·(100 mL)-1，结果表明取样量为15 mL时蛋白质沉淀完全，粗多糖沉淀量适当，样品溶液吸光度值在标准曲线中段，所以确定15 mL为取样量。

2.5 重复性考察 精密量取同一批号混合均匀的样品6份，按上述方法制得待测溶液，比色测定后计算葡聚糖含量，结果6份样品葡聚糖含量的RSD为1.4%，表明该方法重复性良好。

2.6 精密度考察 取制得的待测溶液，按上述方法连续测定6次吸光度，利用标准曲线计算葡聚糖含量，结果6次葡聚糖含量的RSD为0.11%，表明该方法精密度良好。

2.7 稳定性考察 取制得的待测溶液，按上述方法分别于比色后0、1、2、4 h测定吸光度，结果4次葡聚糖含量的RSD为0.96%，表明比色后供试品溶液在室温条件下4 h内稳定。

2.8 回收率考察 精密量取同一批号混合均匀的样品9份，分为3组浓度，每组浓度3份样品，每组分别精密称取葡聚糖对照品约18、22.5、27 mg，置250 mL容量瓶中，分别精密加入混匀的试样7.5 mL，依法制备加标样品。按上述方法进行测定，结果平均回收率在97.1%～100.1%，表明该方法回收率好，结果见表2。

表2 回收率试验结果(n=3)

2.9 方法检出限 参照GB/T 5009.1-2003《食品卫生检验方法理化部分总则》中附录A.2.2规定，检出限为3倍空白值的标准偏差(测定次数n≥20)相对应的质量，吸光法按国际理论与应用化学家联合(IUPAC)规定。检出限按下式进行计算：检出限=Ks/b；b-标准曲线回归方程中的斜率；s-20次空白值的标准偏差；K-一般为3，结果见表3。

表3 检出限试验结果

2.10 样品测定

2.10.1 沉淀蛋白质方法 精密量取3批混合均匀的样品15 mL，按上述方法进行测定，计算葡聚糖含量，结果见表4。

表4 沉淀蛋白质方法样品测定结果

2.10.2 未沉淀蛋白质方法 按样品企业标准规定的检测方法，精密量取3批混合均匀的样品5 mL，置于100 mL容量瓶中，加水80 mL左右，于沸水浴上加热2 h，冷却至室温后补加水至100 mL刻度，混匀，过滤，弃去初滤液，收集续滤液供沉淀粗多糖。沉淀粗多糖及样品测定等步骤均同“2.2”项下方法，结果见表5。

表5 未沉淀蛋白质方法样品测定结果

由表4～5可知，未沉淀蛋白质方法比沉淀蛋白质方法测得的葡聚糖含量高约106 mg·(100 mL)-1，结果差异较大。为找到结果差异的原因，我们做了以下方面的研究。

2.11 含阿胶阴性空白对照溶液测定及比较 根据企业提供33 kg阿胶制成20 000支口服液(20 mL/支)的配方量，计算得口服液中阿胶浓度为82.5 mg·mL-1。为得到和样品相同阿胶含量的阴性空白对照，本研究取阿胶，粉碎，过筛，精密称定8.25 g，置100 mL量瓶中，加水80 mL，水浴煮沸溶解，冷却，加水，定容至刻度，4 000 r·min-1，离心20 min，取上清液备用。

2.11.1 含阿胶沉淀蛋白质阴性空白溶液的制备 精密量取上述上清液15 mL，按“2.2”项下方法制得样品测定液。

2.11.2 含阿胶未沉淀蛋白质阴性空白溶液的制备 精密量取上述上清液5 mL，按“2.10.2”项下方法制得样品测定液。

将上述两种样品测定液按“2.2.3”项下方法进行测定，计算葡聚糖含量，结果见表6。

表6 含阿胶阴性空白对照溶液测定结果

由表6可知，阿胶中的蛋白质对粗多糖测定干扰显著，未沉淀蛋白质的样品溶液比沉淀蛋白质的样品溶液测定结果高约91 mg·(100 mL)-1，这与表4～5两种方法测定结果差值约106 mg·(100 mL)-1相吻合，验证了本研究采用的沉淀蛋白质前处理方法，能够有效去除阿胶口服液中蛋白质对粗多糖测定的严重干扰。

3 讨论

3.1 本研究中阿胶口服液企业标准规定的粗多糖检测方法有提取步骤，该操作是针对固体样品的，且长时间沸水浴可能引起糖结构变化，甚至使碳键断裂而导致所测多糖含量偏低。阿胶口服液是均匀澄清的液体，经验证本法采用沉淀蛋白质的前处理可有效避免上述问题，且能够有效去除蛋白质带来的测定干扰。

3.2 比色法测定多糖并非特异性反应，出现测定结果平行偏差较大，所以试验中沉淀、洗涤、弃上清液、样液的转移等操作都要严谨，实际操作时可增加平行样的测定[11]。