七厘散中红花的显微定量研究

刘子薇，谢林辰，靳羽含，秦雯，厉妲

(北京城市学院生物医药学部，北京 100094)

七厘散首次出现在清代作者谢元庆撰写的《良方集腋·损伤门》一书中，又被称作是神效七厘散，意为治疗效果非常好。方中含有红花、没药、朱砂、麝香、血竭、冰片、乳香等中药。气香，味辛、苦，有清凉感[1]。红花(CarthamustinctoriusL.)，菊科植物的干燥花，在活血祛瘀类中药中使用较为广泛。其性温、味辛[2]，归心、肝经。具有活血通经，祛瘀止痛之效，主要用于治疗女性的经期病、胸痛、瘀伤、身体酸痛等病症[3]。

七厘散既可以口服，也可以外用敷在伤处[4]。现如今七厘散在伤科中逐渐被广泛应用，它不仅可以化去瘀症消去肿块，也可以止痛止血[5]。临床上常常用于跌倒损伤、皮外出血。

花粉粒，在红花粉末中的显微特征相对明显和稳固，它的优点是数目很多，在计算数量上有一定优势，能够方便于在显微镜下进行显微定量。红花花粉粒的特点有以下几方面：颜色上是深黄色，在众多显微特征中颜色突出方便查找，形状上多数是类圆球形、椭圆形或橄榄形，外壁上有短刺和疣状雕纹，具有3个萌发孔，孔口的形状是类圆形或长圆形[6]。

在国家药品标准中，中成药的质量是否达标是很重要的一部分，由于中成药的种类甚多，组成成分相对繁杂，依照现在的统一标准对其质量的评价都不是很全面，范围仍局限在中成药中某单味或多味中药的有效成分的鉴别和检测。近年来，中成药显微定量的研究已增多，逐步成为中成药质量是否符合标准的参照依据[7]。

中药显微定量法是利用中药中某种显微特征具有固定常数的特点，对其进行容量或者重量分析，从而得出中药百分含量的一种中药鉴定方法[8]。利用显微特征常数来测定中药含量的方法具有简便、快速、精确、成本较低等特点，此法更适用于广大基层，且近年来已逐步运用到中成药的质量评价。

1 试验仪器、试剂与药品

1.1 仪器 显微镜：Olympus显微摄影系统，包括：BX-51研究级万能显微镜，配备Olympus DP-72显微镜数码相机(日本奥林巴斯株式会社)；电子分析天平(CP225D，德国赛多利斯集团)；TopPette型微量移液器(大龙兴创实验仪器有限公司)；高速万能粉碎机(FW80，天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试剂 水合氯醛(天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20120321)；甘油(沈阳沈一精细化学品有限公司，批号：20160508)；试验需要的水合氯醛试液依据《中国药典》2015年版(四部)通则8002项下配制。

1.3 药品 本研究所采用的红花样品均由北京城市学院厉妲老师鉴定为菊科植物红花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花。七厘散来自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号分别为：2101015、2101027、2101008。

2 方法与结果

2.1 红花花粉粒的显微特征常数测定方法条件的优选 试验中干扰红花粉末样品混悬效果的重要因素有：X1样品红花的重量；X2过筛的目数也叫作粉碎粒度；X3混悬剂甘油的剂量。因此本试验采用均匀设计的方案来确定红花花粉粒的显微特征常数值的检测条件。考虑几种因素对试验结果的影响，本试验利用U6(63)均匀设计方案[7-10]对其进行考察。

将红花样品分为6组，每组对应的样品重量分别为5.00、9.99、15.01、19.98、25.02、30.03 mg；每组对应的样品粉碎粒度分别为80、100、100、80、80、100目；每组对应加入的甘油量分别为5.0、8.0、4.0、7.0、3.0、6.0 mL。

取红花样品进行粉碎，按照均匀设计表逐一过80目筛、100目筛，让其全数过筛。精密称定5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 mg共6份，将水合氯醛试液依次倒入，经数次研磨后，转移至25 mL容量瓶中，再依次倒入5.0、8.0、4.0、7.0、3.0、6.0 mL的甘油，最终使用水合氯醛试液进行定容。

装片所需的体积：经过预试验发现，样品的装片体积对红花的花粉粒显微特征常数无显著影响，因此可按照试验需要选择装片所需的体积；考虑到被观察物要铺满整个盖玻片并不能溢出，经反复取样验证，最终选择0.02 mL来装片，每份溶液平行装片50张后，放在显微镜下观看红花的花粉粒并计数。

把50张片子的计数结果随机化分为5组(每组10张)，计算出每组片子中红花花粉粒数目的平均值，然后算出5组数据的平均值和其5组数据的RSD值，用每组红花样品平均值的RSD值为考查指标，通过SPSS 19.0软件得出均匀设计的优化结果。试验数据见表1。

表1 红花中花粉粒显微特征常数均匀设计试验结果

均匀设计软件算出的结果:Y=9.428-0.221X1；R2=0.976；F=162.779；Ymin=2.798(即2.80%)。

X1项为负，所以X1要取最大值；X2、X3没有进入方程式，说明X2、X3对试验的结果影响可以不用考虑，X2、X3的值可根据实际情况进行条件选择。

即红花样品的优化条件为X1样品的重量:30.0 mg；X2粉碎的粒度:100目;X3加入的甘油量:6 mL。

验证均匀设计试验：红花样品粉末3份(每份30.0 mg并过100目筛)，精确称定后通过水合氯醛试液进行数次研磨，到转移到25 mL容量瓶中，倒入甘油6 mL，最终通过水合氯醛试液进行定容，完全摇匀后精确吸取0.02 mL所配的红花样品溶液，平行制片50张，于显微镜下查看红花的花粉粒并计数，将所得数据随机化分为5组，算出每一组数据的RSD值。

验证成果中，3份红花的花粉粒特征常数平均值分别为：60.50、59.84、60.36 个/mg，优化条件给出的最小RSD是2.80%，各样品的RSD各自为2.74%、2.54%、2.72%，每一份样品的RSD都不超过优化条件列出的最小RSD(2.80%)，说明本均匀试验设计方案合理。下文红花中花粉粒显微常数测定试验都根据均匀设计给出的优化成果来操作。

2.2 红花花粉粒显微特征常数值测定 30.0 mg精确称取红花重量后根据均匀设计方法，察看并记录每张片子中红花花粉粒的数量。取其数目平均值，根据公式1计算红花花粉粒显微特征常数值。结果见表2。

表2 红花样品花粉粒显微特征常数值测定结果

公式1：显微特征常数P=(X×V)/(V′×W)，这当中，P 表示定量药物的显微特征常数，单位是(个/mg)；X 表示每片盖玻片下药物的显微特征数；V 表示定量药物混悬液的总体积，单位是(mL)；V′ 表示盖玻片下药物混悬液的体积，单位是(mL)；W 表示药物的重量，单位是(mg，以干燥品计)。

根据公式1，依照均匀设计验证试验的成果可计算出红花花粉粒的显微特征常数值为2 807.19个/mg。

2.3 七厘散中红花的含量检测 中成药前处理：将七厘散粉碎后直到全部过100目筛，备用。

为防止结果出现误差，用于显微定量的药材及中成药应按干燥品计算。七厘散样品按照《中国药典》2015年版中的烘干法[1]来测定：取经过粉碎后的七厘散粉末 2～5 g，平铺在干燥且重量恒定的称量瓶中，厚度不大于 5 mm，精确称取后，移放至烘箱中，打开瓶盖，温度设置 80 ℃干燥 5 h，将瓶盖盖好，冷却 30 min，精确称取重量后，再用上述温度干燥 1 h，冷却，称重，直到接连两次重量的差异少于5 mg 为止。依照减失的重量，算出供试品中的含水量(%)。具体含量见表3。

表3 3种七厘散样品水分测定

将七厘散粉碎后直至完全过100目筛，精确称取干燥后的中成药的粉末200 mg各3份，按照均匀设计方法制片，记录花粉粒显微特征数，按照公式2算出红花百分含量，试验结果见表4。

表4 七厘散中红花花粉粒的显微定量测定

公式2：样品含量%=(X×V)/(V′×W×P)×100%

X表示每片盖玻片下药物显微特征常数；V 表示定量药物混悬液总体积(mL)；V′表示盖玻片下药物混悬液体积(mL)；W表示药物重量(mg，按干燥品计)；P表示定量药物显微特征常数(个/mg)。

3 讨论与结论

相较于其他鉴别方法来说，显微鉴别具有所需费用低、执行方法简单、易于操作且普及效果明显等特点[11]。目前我国显微测定技术发展较为成熟，从20世纪80年代起就已经有了显微研究的相关报道，但对于中药材应用尤其是含有红花的中成药方面的显微定量研究少之又少，且试验设计较为凌乱，没有一套准确可行的完整步骤，目前使用较广的非参比物显微定量法在传统显微操作方法的基础上加以改革创新，建立起了一套符合中药材鉴别特点的显微方法与思路，可有效检测有效成分不明的中药材。本试验应用均匀试验设计显微检测方法，有着高度的可推广性与相对准确性。

本次试验将红花作为参照对象，红花由于粉碎后过100目筛，有的花粉粒较完整，有的已破碎。观察时对完整的花粉粒计为一个单位；破碎的花粉粒大于1/2计为一个单位；其他情况忽略不计[12]。对七厘散中的红花含量进行有效性检测。检测结果表明，收集的七厘散中红花的含量符合《中国药典》的标准。应用此检测方法可以为含有红花其他中成药质量评价提供新的技术，简便、迅速地判断是否含有相应中药材且含量是否充足，可为七厘散及含有红花的中成药质量评价提供新的研究思路和方法。