三阳性与三阴性乳腺癌中ERβ亚型的表达①

谭 添，李义强

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

乳腺癌作为最常发生于女性的恶性肿瘤，迄今为止其死亡率随着发病率的升高反而下降，这与我们针对不同乳腺癌患者的个体化治疗密切相关。乳腺癌作为雌激素依赖性肿瘤，有效的内分泌治疗为其良好的预后发挥了举足轻重的作用。据报道，即使ER不表达的部分乳腺癌依然对内分泌治疗敏感，相反，ER表达的乳腺癌一部分却无法在内分泌治疗中得到缓解。根据乳腺癌分子分型我们可知，有两种类型的乳腺癌似乎无法从传统的内分泌治疗中受益，它们分别为三阳性乳腺癌(ER、PR、Her-2受体均为阳性)与三阴性乳腺癌(ER、PR、Her-2受体均为阴性)。如今，我们希望通过系列研究去填补二者的治疗空缺。据相关研究证实，在雌激素家族受体中，除了大家熟知的ERα受体，还有一部分ERβ受体的表达情况与乳腺癌的预后及内分泌治疗也存在一定联系，尽管有相关文献记载，但对于ERβ的作用还未曾形成定论[1]。

ERβ受体最早发现于老鼠的前列腺和卵巢中[2]， ERβ及其亚型在雌激素信号转导及雌激素依赖性肿瘤的发生发展过程中起到关键性作用[3]。目前，对于内分泌治疗不敏感的三阳性及三阴性乳腺癌来说，ERβ在它们中的表达情况、与二者临床病理和预后的关系，以及ERβ能否作为除ERα外另一个对内分泌治疗敏感的因子治疗三阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌，都值得我们期待。

1 材料和方法

1.1 材料

收集佳木斯大学附属第一医院2013-06～2019-05，术前未行任何治疗并于我院行改良根治术的原发性单侧乳腺癌组织病理蜡块标本，三阳性乳腺癌72例，三阴乳腺癌58例。纳入标准为：① 经慢速病理回报确诊者；② 女性患者；③ 免疫组化及病理资料完整者。排除标准：COX风险回归中未取得复发时间的患者资料。

1.2 检测方法

将福尔马林液固定、石蜡包埋的癌组织进行5μm连续切片，然后对标本进行脱蜡及水化，置于免疫组化抗原修复缓冲液中，后滴加内源性过氧化物酶阻断剂孵育10min再用PBS缓冲液进行冲洗(3min/次，共3次)。滴加一抗(兔来源，购自维百奥(北京)生物科技有限公司)，后行孵育及PBS缓冲液冲洗，加入二抗(兔来源，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)再行孵育及冲洗，随后加入配置的DAB显色液室温孵育8min，最后经苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。

1.3 评价标准

在癌组织中对ERβ行免疫组化染色后，随机选择5个高倍视野进行评分。染色强度评分：无色为0分，浅黄色为1 分，黄色为2分，棕褐色为3分。单位镜下ERβ阳细胞所占比率评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数目所占比例1%～25%为1分，阳性细胞数目所占比例26%～50%为2分，阳性细胞数目所占比例51%～75%为3分，阳性细胞数目所占比例76%～100%为4分。最后总分为癌细胞的染色强度和阳性细胞所占比率两项评分的总和：若总评分≥3分则判定ERβ表达阳性；﹤3 分为ERβ表达阴性。其次，分别记录两种乳腺癌患者的年龄、肿块大小、组织分级、淋巴结转移情况、ki-67表达及三年复发情况，并统计。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件分析数值，计数资料组间比较采用四格表χ2检验、Fisher’s 精确检验。采用COX生存曲线比较两种乳腺癌组织中ERβ表达与复发的相关性。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三阳性乳腺癌和三阴乳腺癌组织中ERβ蛋白的表达情况

三阳性乳腺癌组织中ERβ蛋白表达阳性52例(72.2%)(图1)，三阴性乳腺癌组织中ERβ蛋白表达阳性32例(55.2%)(图2)，两种乳腺癌组织中ERβ蛋白的阳性表达率差异有统计学意义。见表1。

表1 三阳性乳腺癌和三阴乳腺癌组织中ERβ蛋白的表达情况

图1 三阳性乳腺癌ERβ阳性表达(免疫组织化学染色 ×200)

图2 三阴性乳腺癌ERβ阴性表达(免疫组织化学染色 ×200)

2.2 三阳性乳腺癌中ERβ蛋白的表达及与临床病理的关系

在三阳性乳腺癌中，ERβ蛋白与淋巴结的转移情况不具有统计学意义(P>0.05)。≤40岁的患者其ERβ蛋白阳性表达率为38.1%，>40岁的患者其阳性表达率为86.3%(P<0.05)；本组中的ERβ蛋白按肿瘤大小的不同≤2cm和>2cm，其阳性表达率分别为94.7%和61.2%(P<0.05)；而分期为Ⅰ、Ⅱ期的ERβ蛋白其阳性表达率为84.8%，高于Ⅲ期ERβ蛋白的50.0%(P<0.05)；在病理学分级为Ⅰ级+Ⅱ级和Ⅲ级组中的阳性表达率分别为80.8%和50.0%(P<0.05)；三阳性乳腺癌中ki-67高表达组与低表达组中的ERβ蛋白表达率分别为57.9%、88.2%(P<0.05)。见表2。

表2 三阳性乳腺癌中ERβ蛋白的表达及与临床病理间的关系

2.3 三阴性乳腺癌中ERβ蛋白的表达及与临床病理的关系

三阴性乳腺癌组织中，ERβ蛋白与患病年龄及淋巴结转移情况间不具有统计学意义(P>0.05)。本组中ERβ蛋白在肿瘤大小为≤2cm和>2cm组中的阳性表达率分别为85.8%和45.5%(P<0.05)；本组中分期为Ⅰ、Ⅱ期的ERβ蛋白阳性表达率为79.2%，高于Ⅲ期的38.2%(P<0.05)；在病理学分级为Ⅰ级+Ⅱ级和Ⅲ级组中的阳性表达率分别为72.7%和32.0%(P<0.05)；且ki-67高表达组与低表达祖中的ERβ蛋白表达率分别为46.3%、76.5%(P<0.05)。见表3。

2.4 三阳性及三阴性乳腺癌复发COX回归分析影响因素

采用单因素Cox分析三阳性和三阴性乳腺癌中对于复发有意义的影响因素，结果表明年龄<40岁和ERβ的阴性表达分别为肿瘤复发的独立影响因素，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4～5。

表3 三阴性乳腺癌中ERβ蛋白的表达及与临床病理间的关系

表4 三阳性乳腺癌复发Cox回归分析影响因素

表5 三阴性乳腺癌复发Cox回归分析影响因素

3 讨论

对于三阳性乳腺癌与三阴性乳腺癌的非手术治疗及术后辅助治疗方式的探究已经引起了医学界的广泛重视，因其分子分型表达的特殊性，故目前还未曾出现明确内分泌治疗的靶点针对二者进行精准治疗。同属雌激素受体的ERβ虽然在DNA与配体结合区和ERα 高度同源，而在A/B区，D区及F区却展现了较高的特异性，所以ERβ既带有某些令人熟知的生物学功能又有着让人未曾发掘的生物学效应。

3.1 ERβ亚型在三阳性与三阴性乳腺癌中的表达

多项研究表明，在乳腺正常组织、不典型增生及癌组织中，ERβ的表达逐渐降低，部分学者认为ERβ可作为预判乳腺癌预后较好的靶点之一，主要原因可能为ERβ1能抑制Efp蛋白表达，从而影响乳腺癌细胞活性。另外有研究提示ERβ的表达可抑制ERα的表达，故在ERβ表达的乳腺癌中因ERα的被抑制，癌细胞增殖也受到影响。本次试验中，ERβ在三阳性乳腺癌中的表达明显高于在预后较差的三阴性乳腺癌中的表达，也间接证实了这一观点。

3.2 ERβ亚型与临床病理的关系

本实验显示，无论三阳性乳腺癌或是三阴性乳腺癌中，ERβ的表达都与年龄、肿瘤大小、肿瘤分期、肿瘤分级以及ki-67的表达有关，且提示肿瘤恶性程度越低其表达越高，这一结论也与国内一些实验结果[4]相一致。研究证实，ERβ主要通过三种方式进行信号传导，分别为以二聚体为基础的经典途径、在转录因子帮助下进行转录的非经典途径和G蛋白偶联信号转导通路，雌激素受体在任何下游通路中表达异常都会影响肿瘤的转移及复发。有基础研究显示，ERβ表达的下降使其失去了对于正常乳腺细胞调控的作用，增加了癌细胞侵袭和转移的风险。显然，ERβ的低表达可促使乳腺癌发生发展，虽然纳入患者标准及随访时间的不同可能会对实验结果造成一定差别，但本实验结果依然支持ERβ作为一种保护性因子存在于不同类型的乳腺癌中。

3.3 ERβ亚型与预后及复发

本次实验三阳性与三阴性3年复发率分别为22.4%和25.9%，年龄与ERβ的表达情况是两种类型类型乳腺癌独立的复发影响因素，表明发病年龄较低、ERβ的低表达可预示其不良的预后，这与国内外相关研究得出的结论相符[5,6]。且1～3年为乳腺癌术后复发高峰期也有学者胡一迪等研究的证实。在三阳性与三阴性乳腺癌中，ERβ阳性率较高的组别其3年复发率明显降低。这也印证了ERβ的高表达能维持乳腺细胞的正常生理功能，抑制乳腺细胞的异常增值，从而限制乳腺癌细胞的转移能力。对于其分子机制的相关研究证实，经ERβ转染的乳腺癌细胞可出现明显G1/S期停滞，甚至诱导凋亡，从而抑制肿瘤生长。目前对于三阴性乳腺癌的内分泌治疗研究还在经受发病数量上的限制，故还无法完全明确影响其预后的因素，相关文献提示ki-67的表达、淋巴结转移情况以及代谢情况等都会影响其预后[7,8]，故需要扩大样本量以及增加随访时间来进一步探究。

3.4 三阳性及三阴性乳腺癌的内分泌治疗

在三阳性乳腺癌中，乳腺癌细胞由HR通路及活化的Her-2蛋白共同介导，二者通路形成交联网络[9]。所以当抑制ER通路后，活化的Her-2蛋白依然可以促进细胞的增值，另外，Her-2通路可介导其下游分子激活ER，使ER进行非配体依赖性生长。二者共同导致三阳性乳腺癌对内分泌治疗产生耐药性。目前对于三阳性乳腺癌的辅助治疗依然更倾向于曲妥珠单抗与帕托珠单抗的双靶向治疗加芳香化酶抑制剂。但有研究显示ERβ的高表达可增加他莫昔芬对肿瘤细胞的增殖抑制作用，即降低对内分泌治疗的耐药性,且对于ERα与ERβ共同表达的肿瘤细胞可增加他莫昔芬的反应性。故对于三阳性乳腺癌来说ERβ表达阳性的患者似乎对内分泌治疗受益更多，相关研究还在进行，但这却让ERβ在内分泌治疗领域更受关注。对于三阴性乳腺癌来说，因发病年龄低，预后差，易转移且对传统内分泌及靶向治疗反应性差，使得这一类患者在治疗过程中受到了莫大的限制[10]。部分ERα表达阴性的乳腺癌中还有一部分表达为ERβ阳性，即ERα-/ERβ+，而如今存在大约 10%的ERα阴性患者依然会对内分泌治疗敏感。那么，ERβ能否成为新靶点针对部分ERα-/ERβ+的三阴性乳腺癌患者提供更加广阔的治疗手段似乎值得我们期待。

综上所述，本实验依然存在诸多不足，例如未彻底排除ERβ其他亚型可能对实验产生的干扰、未从基因及分子层面进一步研究以及样本量不足等。针对ERβ在不同类型乳腺癌中的表达及其对内分泌治疗产生的影响还需要更多样本量及不同实验方法来更深一步的证实。