痰瘀同治方调控自噬对心肌缺血区和动脉粥样硬化斑块内血管新生不同作用的实验研究

浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

近年来研究发现，血管新生既是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)不稳定斑块形成的关键，又是改善心肌缺血有效的代偿途径[1]。因此，在促进缺血心肌区血管新生和抑制斑块内血管新生的临床决策中，存在着内在的矛盾，如何在治疗中兼顾这对矛盾是现实存在的难题。目前研究多将两者孤立开来作为独立的对象，而将两者结合进行同步研究，国内外尚未见有报道。痰瘀同治(Tanyu Tongzhi，TYTZ)是目前中医防治AS和改善心肌缺血的主要治法治则[2-3]。前期工作中已经证实TYTZ方能够通过抑制大鼠AS斑块内血管新生，稳定并消退AS斑块[4]；临床研究也证实，TYTZ方能够显著改善冠心病患者的心肌缺血症状[5]，这提示TYTZ方对AS斑块内和缺血心肌区的血管新生具有双向调节作用。已知自噬与血管新生关系密切，不同环境下的自噬对血管新生存在不同的作用[6]。因此，本研究拟建立心肌缺血和AS斑块内血管新生的双靶点小鼠模型，采用CD31免疫组化染色法评价TYTZ方对心肌缺血区和AS斑块内血管新生的不同作用，同时观察自噬标志性蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅱ/Ⅰ表达水平的变化，分析其中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8周龄雄性C57BL/6J小鼠10只，雄性载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E gene Knockout，ApoE-/-)小鼠20只，体重均为20～24g，由上海斯莱克公司提供［实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005］，饲养于浙江中医药大学实验动物研究中心屏障环境实验室［实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2018-0012］。实验期间，遵循3R原则给予实验动物人道主义关怀，实验动物福利伦理审查号［ZSLL-2017-107］。

1.1.2 药物与试剂 TYTZ方由石菖蒲、全瓜蒌、陈皮、薤白、丹参、水蛭、郁金、茯苓组成，由浙江中医药大学制剂中心加工为流浸膏，含生药2g·mL-1。异丙肾上腺素原药购自美国Sigma公司 (批号：SLBH1026V)；抗LC3Ⅱ/Ⅰ抗体购自英国Abcam公司(批号：ab48394)；CD31鼠单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司(批号：3528S)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组、造模与给药方法 取ApoE-/-小鼠20只，随机分为模型对照组和TYTZ组，每组10只，饲喂高脂饲料 (小鼠基础饲料+15%猪油+1.25%胆固醇)；另取C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组，饲喂基础饲料。饲喂4周后，模型对照组和TYTZ组腹部皮下多点注射100mg/kg异丙肾上腺素针，持续2d；正常对照组皮下注射等量0.9%氯化钠注射液。造模成功后4周分别开始药物干预，根据人与小鼠的换算系数决定给药剂量，按TYTZ方成人剂量换算后的小鼠等效剂量的5倍，TYTZ组给予TYTZ方流浸膏2 145mg/(kg·d)灌胃(蒸馏水稀释成0.4mL)；模型对照组和正常对照组给予等量蒸馏水灌胃，均连续给药6周。

1.2.2 标本取材 试验结束后，过量麻醉处死动物，开胸后小心分离并剪取心脏及整条主动脉。主动脉分段横切留存，心脏按短轴面留取心肌标本，模型对照组和TYTZ组留取心肌梗死边缘区组织送检。各组标本分类编号，一部分放入液氮冻存，另一部分直接冷冻切片。

1.2.3 免疫组化检测各组心肌和主动脉新生血管密度 对各组标本行内皮细胞特异性标志物CD31染色，内皮细胞的细胞质染为棕黄色即为阳性表达。以Imaging System检测阳性细胞平均光密度值(mean optical density，MOD)，作为评价新生血管密度的定量指标。

1.2.4 Western blot检测各组心肌和主动脉的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平 提取病理组织总蛋白后采用Western blot测定各组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达，以凝胶图象处理系统分析各组目的蛋白条带与内参照β-actin蛋白条带的比值，即为LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。所有数据以±s表示，两组之间均数比较采用Bonferroni检验，多组之间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌组织内新生血管密度比较 免疫组化染色显示，TYTZ组新生血管表达最丰富。与正常对照组比较，模型对照组及TYTZ组的CD31表达均显著增加(P＜0.05)；与模型对照组比较，TYTZ组CD31表达明显增加(P＜0.05)。见图1、2。

2.2 各组主动脉新生血管密度比较 免疫组化染色显示，与正常对照组比较，TYTZ组与模型对照组CD31表达均明显增加(P＜0.05)；而与模型对照组比较，TYTZ组的CD31表达则明显减低(P＜0.05)。见图3、4。

图1 各组心肌组织CD31免疫组化染色(100×)Fig.1 The imaging of myocardial tissue with CD31 immunohistochemical staining in each group(100×)

2.3 各组心肌组织LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比较 与正常对照组比较，模型对照组和TYTZ组的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均明显增高(P＜0.05)；与模型对照组比较，TYTZ组的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显增高(P＜0.05)。见图5。

2.4 各组主动脉LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比较 与正常对照组比较，模型对照组的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平明显增高(P＜0.05)；与模型对照组比较，TYTZ组的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)。见图6。

3 讨论

图2 各组心肌组织新生血管密度比较Fig.2 The density of neovascularization of myocardial tissue in each group

图3 各组主动脉CD31免疫组化染色(100×)Fig.3 The imaging of aorta with CD31 immunohistochemical staining in each group(100×)

血管新生一方面是改善心肌缺血的有价值的补偿手段，另一方面又是导致AS斑块不稳定的核心因素，血管新生的两方面作用正逐渐吸引着研究者的兴趣。在临床工作中，当一项干预措施具有拮抗AS斑块内新生血管的作用时，它也可能具有抑制缺血心肌内微血管形成的不良作用；或者当一项干预措施有利于缺血心肌内微血管形成时，它同样也可能促进AS斑块内新生血管形成，从而加重斑块的不稳定性。所以临床医师必须意识到，在临床上已经被广泛应用的各种抗心肌缺血的中药制剂，或是在肿瘤治疗中各种抗血管新生的药物，都存在安全性风险[7]。目前国内外学者多将AS斑块或缺血心肌内的血管新生孤立开来，分别对其进行研究。而将两种不同病理环境中的血管新生结合在同一动物模型中，同步研究一种干预措施对两者的不同作用，国内外尚未见于报道。

图4 各组主动脉新生血管密度比较Fig.4 The density of neovascularization in aorta in each group

图5 各组心肌组织LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比较Fig.5 Comparison of LC3Ⅱ/Ⅰ protein expression of myocardial tissue in each group

图6 各组主动脉LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比较Fig.6 Comparison of LC3Ⅱ/Ⅰ protein expression of aorta in each group

自噬与血管新生关系密切。体外研究发现，阻断自噬发生可阻断血管内皮生长因子介导的人脐静脉内皮细胞迁移和管型形成，抑制血管新生[8]。反之，通过上调自噬信号分子能够激活血管内皮细胞表面的内皮生长因子受体2，促进新生血管形成[9]。上述研究表明，激活自噬能够促进血管新生，而下调自噬水平则抑制血管新生。但在肿瘤内病理性血管新生的研究提示，内皮抑素在上调自噬水平的同时却能够抑制肿瘤内病理性血管新生[10]。自噬究竟是抑制还是促进血管新生，与自噬存在的两面性有关，只有恰当水平的自噬才能发挥其保护作用，这也可以说明自噬对血管生成的影响[11]。国内外关于自噬的研究目前多局限于肿瘤和眼底病理性血管新生领域，而有关自噬是否参与心肌缺血区或AS斑块内血管新生的研究目前尚未见报道。

TYTZ是中医防治AS和改善心肌缺血的主要治法治则[2-3]。本课题组在经典古方“瓜萎薤白半夏汤”和“血府逐瘀汤”基础上，结合长期临证经验总结形成了TYTZ方，方剂组成包括全瓜蒌、薤白、石菖蒲、郁金、丹参、水蛭、茯苓、陈皮，具有除湿祛痰、活血化瘀之功效。前期研究证实，TYTZ方具有抑制AS斑块内血管新生的作用[4]。长期大量的临床实践也发现，TYTZ方对冠心病痰瘀互结证具有显著的临床疗效[5]。这些研究提示TYTZ方对AS斑块内和缺血心肌区的血管新生可能存在双向调节作用，但其中作用机制需要进一步研究。

采用皮下多点注射异丙肾上腺素针的方法对ApoE-/-小鼠进行干预，本研究团队在国内外首次成功建立了心肌缺血和AS斑块内血管新生的双靶点小鼠模型[12]。进一步对内皮细胞特异性标志物CD31进行免疫组化染色，检测了TYTZ方对单一实验动物体内心肌缺血区和AS斑块内新生血管密度的影响。结果发现，在心肌缺血区，TYTZ组CD31表达明显高于模型对照组；而在主动脉斑块中，TYTZ组CD31表达明显低于模型对照组，证实了TYTZ方在抑制AS斑块内血管新生的同时能够促进心肌缺血区的血管新生。

LC3Ⅱ/Ⅰ是最早发现的自噬标志性蛋白，LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量与自噬小体数量正相关，是反映细胞自噬活性的关键指标，也是目前最常用的自噬水平检测标志物[13]。本研究结果显示，模型对照组心肌组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著高于正常对照组，而TYTZ组的LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平又显著高于模型对照组，这提示TYTZ方通过进一步上调自噬蛋白表达，进而促进心肌缺血区内血管新生；在主动脉中，模型对照组的LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平显著高于正常对照组，TYTZ组的LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平则低于模型对照组，这提示激活自噬也能够促进AS斑块内血管新生，而TYTZ方通过下调斑块内自噬蛋白表达水平，抑制斑块内血管新生。而且本研究提示，自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平与血管新生程度相应。

上述研究结果表明，TYTZ方对心肌缺血区和AS斑块内的自噬水平存在双向调节作用，这可能是该方对血管新生双向调节作用的重要机制。