间歇性低氧大鼠肺内TLR4的表达及影响

邱 丹 余 勤

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea, OSA)因睡眠期间上气道反复塌陷，导致慢性间歇性低氧(intermittent hypoxia, IH)，并引发全身各个靶器官的损害。以多导睡眠图监测过程中呼吸暂停低通气指数(apnea-hypopnea index, AHI) ≥5为诊断标准，OSA在总体人群中的发生率为9%～38%，且随着年龄的增长其发生率增加，男性发生率为10%～50%，女性发生率为3%～24%[1，2]。OSA发生的机制包括低氧诱导因子活化、循环炎症标志物水平增加、氧化应激、内皮功能障碍、肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活及交感神经兴奋性增高等。以上任何一种病理生理变化都可能导致不同器官、组织的病理改变，产生一系列并发症[3，4]。

TLR4作为一种炎性介质，通过依赖MyD88和不依赖MyD88的途径产生大量细胞因子和促炎性细胞因子，在先天性和适应性免疫中起关键作用。经典的信号转导途径是MyD88依赖性的，主要通过介导促炎性细胞因子的产生和NF-κB通路的活化触发下游级联反应，表达IL-6和TNF-α[5]。有研究表明，OSA患者单核细胞中TLR4表达显著增加，TLR4在肺内的表达增加可能产生一系列改变，增加OSA合并肺气肿、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、肺间质纤维化和肺癌及其他肿瘤发生的可能[6]。

材料与方法

1.实验动物及分组:4～6周龄的SPF级健康雄性Wistar大鼠48只，体质量280～300g，购买于甘肃中医药大学动物中心，实验动物许可证号为SCXKGan2013-0002，饲养于兰州大学第一医院实验动物中心。实验开始前在安静、自然光照、温度(20～25℃)及湿度适宜(45%～60%)的环境下使用同种水源、饲料及垫料饲养1周使大鼠适应实验室环境。每日于统一时间投放标准饲料和灭菌水，实验期间动物可在饲养仓内自由活动、自由饮食，无外界不良刺激和干扰。用数字表法将大鼠随机分为4组(每组8只)，分别为A组(常氧组)、B组(轻度低氧组，即氧浓度为15%)、C组(中度低氧组，即氧浓度为9%)和D组(重度低氧组，即氧浓度为6%)。每日造模8h(9:00～17:00时)，连续造模35天。

2.仪器与试剂：(1)仪器：间歇性低氧装置的组成为密闭大鼠饲养笼、氮气/氧气储气瓶程控仪、电磁式空气压缩机和控制系统。控制系统包括减压阀、流量计、电磁阀及数字显示时间继电器等。CY-12C型测氧仪(浙江省建德市梅城电化学分析仪器厂)。氧气和氮气由甘肃省兰州方圆建化有限责任公司供应。TKY-BMB摊片烤片机(湖北泰康医疗设备有限公司)。(2)试剂：羊抗TLR4兔抗体(成都正能生物产品公司)；山羊抗属二抗；辣根标记酶； DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)；3%过氧化氢、二甲苯、无水乙醇及PBS缓冲液均由兰州大学第一医院病理科配制。

3.模型建立及实验分组：参照文献[7]的方法建立间歇性低氧的模型舱：低氧+复氧共120s为1个循环周期。首先开通压缩氮气30s，设定自动控制系统使间歇性低氧模型舱内的氧浓度由20%～21%迅速下降(其中A组下降至15%，B组下降至9%，C组下降至6%)，停止供气10s使B、C、D舱内氧浓度分别维持在15%、9%和6%，随后开通压缩氧气20s，使舱内的氧浓度在20s内迅速恢复至20%～21%，最后开通压缩空气60s维持舱内20%～21%的氧浓度。A组在饲养造模过程中持续输入与其他组等流量的压缩空气，使实验动物舱内的氧浓度维持在21%。过程中使用测氧仪实时监测舱内氧浓度。造模时间为8小时/天，共35天。其余时间所有大鼠均饲养于氧浓度为21%的适宜温度及湿度的清洁室内环境。

4.取材:造模35天后，禁食12h，于第36天清晨称重并记录后以10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，无菌条件下在冰块上快速解剖肺组织，留取右肺上叶并于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色和免疫组化。

5.组织病理学检测:(1)HE染色：将固定后的大鼠右肺组织进行常规石蜡包埋，制作成4μm厚的切片，常规脱蜡后进行HE染色。(2)免疫组化：切片常规脱蜡后在烤片机上设定65～70℃烤片1h，常规使用二甲苯脱蜡，乙醇脱水，PBS缓冲液中浸泡5min，柠檬酸盐中进行抗原修复，冷却后于PBS浸泡5min，于3%过氧化氢浸泡10min，使用羊抗TLR4兔抗体用PBS液1∶50稀释后于37℃恒温箱中孵育 2h，使用DAB显色剂显色后常规脱水在光学显微镜下检查组织样品，使其透明，然后固定于载玻片上封片。随机选取各组切片，每组分别5张，使用100倍镜观察肺组织内TLR4的表达情况，如果细胞膜或细胞质是棕色的，则确定结果为阳性，如果蓝色则为阴性。每张切片选取14个视野采集图像，根据染色面积和强度，应用Image Pro Plus6.0图像分析软件对肺组织中的TLR4受体进行半定量分析，以此判断大鼠肺组织中TLR4的表达情况。

结 果

1.肺组织HE染色病理切片结果：A组肺组织未见明显异常，B、C、D这3组中肺间隔增宽，肺组织内均有淋巴细胞浸润，其中B组可见少量巨噬细胞，无尘细胞，C组、D组中均可见尘细胞和巨噬细胞，且D组明显多于C组；B、C、D这3组均有细支气管黏膜上皮细胞的改变，其中D组可见肺间质的炎性细胞浸润并伴有肺气肿改变，部分肺泡扩张，肺泡间隔变窄并断裂，相邻肺泡融合成较大的囊腔，肺泡间隔内毛细血管床数量减少，小支气管和细支气管可见慢性炎症改变，详见图1。

2.肺组织TLR4表达水平：在大鼠的肺组织中，TLR4主要表达于肺泡上皮细胞和气管、支气管黏膜上皮细胞的细胞膜和细胞质[8,9]。讨论使用DAB染色后用免疫组化法检测，TLR4于表达的细胞呈现棕黄色，与A组比较，B、C、D这3组大鼠肺组织的棕黄色染色更深,其中D组染色最深，B、C、D这3组中TLR4水平呈梯度表达，即D组TLR4表达水平最高，差异有统计学意义(P=0.000)。A、B、C、D 4组的大鼠肺组织TLR4阳性表达的平均吸光度分别为，A组0.2100±0.0246，B组0.2193±0.0317(P=0.000)，C组0.2584±0.0539(P=0.000)，D组0.3501±0.0656(P=0.000)，差异均有统计学意义，详见图2。

讨 论

慢性间歇性缺氧(CIH)中缺氧-复氧变化是OSA的典型病理生理过程，在此过程中会产生许多活性氧(ROS)，从而使机体发生氧化应激，并降低低氧诱导因子(HIF-1)、NF-κB和激活素1(AP-1)的活性[10]。其中，NF-κB是重要的炎性反应起始因子，可在缺氧的情况下被激活，并随着缺氧时间延长而增加。OSA促进NF-κB通路活化，使下游炎性介质和细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-8等表达增加，导致炎症和炎症瀑布效应。TLR4作为一种炎性因子，一般由经典的MyD88依赖性通路激活，通过诱导促炎因子的产生和NF-κB通路的活化产生下游的相关炎性因子，CIH产生的一系列病理生理改变都共同促进这条炎症通路的激活。TLR4在白细胞表达，能刺激诱导促炎性细胞因子和趋化因子产生，而人肺巨噬细胞(lung macrophages， LMs)是抵抗吸入病原体的第一道防线，刺激人类LMs中的TLR4会诱导细胞因子和趋化因子产生[11]。

TLR是跨膜蛋白，主要感应病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，但也可以与损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns， DAMPs)结合诱导免疫反应，后者主要通过转录因子、炎性基因的修饰表达和细胞因子的产生来实现。TLR4位于细胞表面，能感知脂肽、鞭毛蛋白和脂多糖(LPS，革兰阴性细菌的细胞壁成分)等外部的微生物成分，在人肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages, AMs)中表达。TLR4信号转导参与了早期的细胞因子反应，从而放大了炎症并募集其他细胞来对抗入侵的微生物，巨噬细胞特别参与细胞因子的产生。激活TLR4后，AMs会释放炎性因子，TLR4识别的吸入微生物可能会引起肺部感染等疾病。TLR刺激后产生的趋化因子大多涉及炎症的发生，然后通过募集不同类型的细胞来维持炎症，靶细胞类型与肺部疾病有关。

本研究中TLR4在不同程度的缺氧大鼠肺组织中表达不同，以间歇性缺氧程度最重的D组大鼠中表达最丰富，结合其他研究，本研究验证了TLR4表达水平随着缺氧程度的加重而增加的这一结论。但本研究除了验证间歇性缺氧使肺组织TLR4的表达增加外，还要讨论TLR4表达的增加对肺以及其他器官产生的可能影响。

TLR4通过促进内皮细胞抗氧化的防御作用而在肺稳态中起着关键作用。TLR4缺陷可导致动物出现肺气肿，这可能与氧化及抗氧化的失衡有关，TLR4表达的差异与COPD的进展有关，在人类的肺气肿中，减少TLR4的表达与更严重的肺气肿和气道阻塞有关。为了验证TLR4表达的差异是否与肺气肿或气流受限有关，有研究者用实验验证TLR4与肺气肿严重性的相关性，结果表明，随着TLR4表达增加，FEV1/FVC增加，肺气肿评分降低。随着TLR4表达水平的降低，气流限制也变得更加严重。在TLR4缺陷小鼠的上皮细胞中，自噬蛋白LC3B的表达和反应香烟烟雾暴露的凋亡细胞的标志物增加[12]。总之，吸烟者肺中TLR4表达下调与肺气肿和气流受限有关，TLR4在烟雾诱导的肺气肿形成中起保护作用。但是，本实验并无吸烟的干预条件，因此随着缺氧程度的加重，TLR4表达增加，肺气肿的病理变化反而加重，因此还需要进一步研究来阐明TLR4表达下调与肺气肿之间的因果关系以及吸烟在其中的作用。

TLR4通过衰老相关基因表达的表观遗传调控，在维持肺的动态平衡中发挥了新的作用。Huang等[13]研究证实内皮细胞TLR4通过HDAC2-组蛋白H4-p16INK4a抑制细胞衰老，是通过HDAC2介导的组蛋白H4去乙酰化抑制内源性p16INK4a表达，从而发现了此前未被认识到的TLR4在预防衰老相关基因p16INK4a表达中的作用。肺内皮细胞p16INK4a的沉默阻止TLR4-/-诱导肺气肿，揭示p16INK4a在肺中的新功能作用。基于免疫组化的TLR4表达差异在支气管和肺泡上皮细胞中最明显，TLR4的免疫组织化学染色显示支气管和肺泡上皮细胞是显示TLR4表达差异的主要细胞。肺泡巨噬细胞在所有患者中均表现出较高的TLR4表达，因此对各组间的表达差异无贡献，但是，本实验中每组大鼠的TLR4表达均以巨噬细胞为主，且不同缺氧条件下的表达量差异有统计学意义(P<0.05)，因此，本实验仍以巨噬细胞表达的TLR4作为讨论的基础，由于重度缺氧组的肺泡上皮细胞未观察到有明显的TLR4的表达，所以是否可以认为是导致肺气肿发生的原因仍需进一步加以验证，但可以明确的是TLR4通过促进内皮细胞抗氧化剂的防御作用而在肺稳态中起着关键作用[14]。

TLR4在多种细胞和肿瘤组织中表达，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃肠肿瘤、肝癌和膀胱癌[15]。有研究者发现，TLR4在正常细胞发挥防御作用，在癌细胞起负性作用。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K/Akt)信号转导途径是各种免疫应答和炎症过程的经典介质, 肿瘤微环境中PI3K/Akt信号通路可能是一种潜在有效的对抗措施。有实验证明，革兰阴性大肠杆菌肺炎可通过宿主TLR4激活增强NSCLC转移，并且部分地通过上皮细胞TLR4激活和IL-6释放而得到促进。因此，TLR4是针对革兰阴性菌肺炎增加NSCLC转移的潜在治疗靶标[16]。TLR4抗体、抑制剂或拮抗剂可能会影响乙酰化、二聚作用或TLR4配体/受体的识别，这可能会抑制下游信号的激活，表明这是一种通过靶向TLR4信号进行肺炎治疗的策略[17]。研究还发现TLR4和MyD88与肿瘤进展及肿瘤对化疗药物(如紫杉醇)的耐药性相关。近年来研究表明，几乎所有TLR都参与了增加的癌症发生率、疾病严重程度和不良预后，因此可以用作预防癌症方法的靶点53～55[15]。

TLR4是跨膜蛋白，属于模式识别受体家族, 它的激活导致NF-κB的表达增加，从而增加促炎性细胞因子的产生，促炎性细胞因子负责激活先天免疫系统，后者在博来霉素诱导的肺纤维化的发病机制中起作用。此外，TLR4通过增加α-SMA和Ⅰ型胶原的表达并随后发生纤维化而促进博来霉素诱导的肺损伤中的纤维化。TLR4作为病原体模式识别受体，在调节细胞免疫功能，维持肺泡上皮的稳定性以及炎症后的重建中具有保护作用。但是，在某些病理状态下TLR4的过度表达和激活可能导致不受控制的炎症和纤维化。因此，不同病理状态下TLR4表达的调控机制以及防止TLR4过表达的手段是进一步研究的重要方向。PI3K-Akt是 ALI的早期启动肺纤维化的途径之一。通过用TLR4-shRNA慢病毒转染抑制TLR4表达，可以在ALI早期抑制纤维化过程。因此，这种治疗可能会降低LPS诱导的ALI的严重程度和肺纤维化，从而改善疾病的预后。研究表明，单宁酸(tannic acid, TA)可能直接结合TLR4，从而抑制LPS与TLR4/MD2复合物的结合以及随后的信号转导，在炎症介导的疾病(包括纤维化)中有治疗作用[18]。

TLR4对机体的其他影响：由于TLR4促进慢性间歇性缺氧诱导的肺部炎症，而TLR拮抗剂TAK242可减轻CIH诱导的肺损伤和炎性反应，因此能作为一种治疗手段应用于临床[6]。

综上所述，慢性间歇性低氧通过模拟OSA过程，造成大鼠肺部的炎症，并使肺组织内TLR4的表达增加，且表达量与缺氧程度呈正相关。TLR4作为一个炎性指标，通过MyD88/TLR4/NF-κB通路激活炎症表达，释放炎性因子，可触发一系列肺部疾病，且TLR4表达水平的差异可影响肺部原有疾病的进展，因此，TLR4可作为疾病治疗的靶标，为相关疾病的治疗提供新的思路。