circRNA-ITCH通过TET1基因抑制Wnt/β-catenin信号通路对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的影响

常昆鹏 魏珍星 李 斐 张 炜

鼻咽癌是我国最常见的耳鼻咽喉部位的恶性肿瘤，具有明显的地理分布特征，我国是鼻咽癌的高发国[1]。鼻咽癌的治疗多采用放射治疗，放射治疗后可对残余癌灶行手术切除[2]。然而由于解剖位置较隐蔽，鼻咽癌早期不易发现，导致很多患者确诊时已发生颈部淋巴结转移，导致患者预后不良[3,4]。明确鼻咽癌的发生、发展机制，寻找早期诊断和转移的分子标志物，对改善鼻咽癌患者的预后有重要意义。环状非编码RNA(circRNA)是一种内源性、非编码RNA，由外显子和(或)内含子选择性剪切形成的闭合环状结构[5]。circRNA由于不含3′端和5′端，因而很难被外切核酸酶降解，具有很高的稳定性[6]。近年来，circRNA已被证明在多种肿瘤中异常表达，广泛参与肿瘤细胞的分化、增殖、侵袭、凋亡等恶性生物学行为[7]。circRNA-ITCH是近年来新发现的circRNA，其在膀胱癌、卵巢癌、肺癌等肿瘤中表达明显降低，上调其表达可显著抑制肿瘤细胞的生长和转移，具有明显的抑癌基因作用[8～10]。circRNA-ITCH在鼻咽癌中的表达和作用机制研究尚未报道。本研究通过检测鼻咽癌组织和细胞系中circRNA-ITCH的表达水平, 进一步分析过表达circRNA-ITCH影响鼻咽癌细胞增殖和侵袭的分子机制。

材料与方法

1.材料：(1)组织标本：收集2016年9月～2019年5月笔者医院耳鼻喉科49例鼻咽癌及癌旁组织标本，其中男性28例，女性21例，患者年龄31～65岁，平均年龄49.72±12.15岁。根据2002年国际抗癌联盟(UICC)头颈肿瘤临床分期对鼻咽癌临床分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期12例，Ⅲ期26例，Ⅳ期6例。鼻咽癌标本根据世界卫生组织鼻咽癌组织学分类确定病理诊断：角化性鳞状细胞癌33例，非角化性癌16例。所有患者在标本收集时均未接受放疗、化疗，本研究经笔者医院医学伦理学委员会批准，患者均签署知情同意书。(2)细胞系和主要试剂：RPMI 1640培养基、K-SFM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。鼻咽癌细胞系(HNE-1、CNE-2Z、C666-1、SUNE-1、HONE-1)和人永生化鼻咽上皮细胞(NP69)购自中国典型培养物保藏中心。携有无意义序列的阴性对照质粒和携有circRNA-ITCH的质粒购自上海吉玛制药有限公司。qPCR试剂盒购自美国Roche公司。LipofectamineTM2000和Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。Transwell小室购自美国Corning公司。GAPDH、TET1、Wnt1、PLC、PKC和β-catenin蛋白抗体购自英国Abcam公司。CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司。

2.细胞培养和转染：人永生化鼻咽上皮细胞(NP69)接种于K-SFM(含10%胎牛血清)培养基，鼻咽癌细胞系(HNE-1、CNE-2Z、C666-1、SUNE-1、HONE-1)接种于RPMI 1640(含10%胎牛血清)培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。待CNE-2Z细胞稳定传代后，取对数生长期细胞接种于6孔板，接种密度以转让时融合度达60%为准。根据LipofectamineTM2000说明书进行转染，以无血清RPMI 1640培养基配制转染体系，分别向CNE-2Z细胞转染阴性对照质粒和携有circRNA-ITCH的质粒，分别定义为对照组和实验组。转染8h后，更换为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。

3.qPCR检测组织或细胞中circRNA-ITCH、TET1 mRNA的表达：分别提取组织或细胞总RNA，经紫外分光光度计检测后，取500ng总RNA反转录为cDNA。qPCR反应总体系为20μl。circRNA-ITCH上游引物序列：5′-AGCAATGCAGCAGTTT-3′，下游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′，产物片断197bp。TET1上游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′， 下游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′，产物片断265bp。以GAPDH为管家基因，GAPDH上游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′， 下游引物序列：5′-TGTAGCCCATCAAGACA-3′，产物片断265bp。qPCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 20s，共40个循环。以2-ΔΔCt法计算circRNA-ITCH、TET1 mRNA的相对表达。

4.CCK-8法检测CNE-2Z细胞增殖：将转染后48h的两组细胞消化、重悬，分别以3000个/孔接种于96孔板，细胞悬液体积为200μl。CCK-8检测时，加入15微升/孔 CCK-8溶液，培养箱内培养3h，消除孔内气泡，采用酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光度值，分别于接种后1、2、3、4、5天行CCK-8法检测。

5.Transwell侵袭实验检测CNE-2Z细胞侵袭：按1∶10的比例将RPMI 1640培养基与Matrigel基质胶充分混合，分别在每个Transwell小室上室加入100μl混合物，于培养箱中充分凝固。将转染后48h的两组细胞消化，用无血清的RPMI 1640培养基重悬，分别在每个Transwell小室上室加入200μl细胞悬液(细胞密度为1×105个/毫升)，分别在每个Transwell小室下室加入600μl含血清的RPMI 1640培养基。连续培养24h，取出Transwell小室上室，无水乙醇固定10min，0.1%结晶紫染色染色10min，流水漂洗、晾干后，于显微镜下计数。

6.Western blot法检测各组细胞TET1及下游蛋白的表达：将转染后48h的两组细胞消化、离心，采用RIPA裂解液裂解细胞并提取总蛋白，测定蛋白浓度后，每组按40μg蛋白上样量进行聚丙烯酰氨凝胶(浓度为10%)电泳2h，硝酸纤维素膜转膜2h，采用5%脱脂奶粉封闭3h，分别与一抗GAPDH(1∶3000稀释)、TET1(1∶1000稀释)、Wnt1(1∶2000稀释)、PLC(1∶2000稀释)、PKC(1∶2000稀释)和β-catenin(1∶1000稀释)在4℃下孵育过夜。洗膜后，与二抗(1∶10000稀释)在室温下孵育2h后，均匀滴加化学发光试剂，在凝胶成像系统扫描、拍照，比较目的蛋白表达。

结 果

1.circRNA-ITCH在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达：与癌旁组织比较(图1)，circRNA-ITCH在鼻咽癌组织中表达下调(P<0.01)。

2.circRNA-ITCH在正常肝细胞和鼻咽癌细胞系的表达：与人永生化鼻咽上皮细胞(NP69)比较(图2)，circRNA-ITCH在鼻咽癌细胞系(HNE-1、CNE-2Z、C666-1、SUNE-1、HONE-1)中表达下调(P<0.05)，CNE-2Z细胞中circRNA-ITCH的表达量最低(P<0.01)。

3.检测circRNA-ITCH质粒的转染效率：对照组和实验组CNE-2Z细胞中circRNA-ITCH相对表达量分别为1.00±0.02和8.09±1.12(t=6.34，P<0.01)，质粒转染成功。

4.过表达circRNA-ITCH对CNE-2Z细胞增殖的影响：CCK-8检测结果显示，与对照组比较，实验组的CNE-2Z细胞从第2天开始，增殖能力降低(P<0.05,图3)。

5.过表达circRNA-ITCH对CNE-2Z细胞侵袭的影响：对照组和实验组CNE-2Z细胞侵袭细胞计数分别为80.17±7.64个和39.12±6.57个(P<0.01)。与对照组比较，转染circRNA-ITCH后的鼻咽癌细胞侵袭能力被抑制(图4)。

6.两组细胞中TET1 mRNA的表达：对照组和实验组CNE-2Z细胞中TET1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.04和5.03±0.50(t=7.98，P<0.01)。与对照组比较，实验组细胞中TET1 mRNA的表达增加。

7.过表达circRNA-ITCH对TET1蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响：Western blot法结果显示，与对照组比较，过表达circRNA-ITCH后，TET1蛋白表达明显增加，Wnt1、PLC、PKC和β-catenin蛋白表达明显降低(图5)。

讨 论

circRNA主要位于细胞质，是一种由共价键形成的闭合环状RNA分子，结构非常稳定，可通过多种方式影响目的基因的表达，调控细胞的生命活动[11]。近年来，不断有新的circRNA如HIPK3、LARP4、ZNF609被证实在鼻咽癌中异常表达，参与鼻咽癌的发生、发展[12～14]。circRNA-ITCH是一种新发现的circRNA，Yang等[15]研究显示，circRNA-ITCH在膀胱癌组织和细胞系中低表达，且circRNA-ITCH的表达水平越低，膀胱癌患者的生存期越短；过表达circRNA-ITCH可通过吸附miR-17和miR-224，抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Luo等[16]研究显示，circRNA-ITCH在卵巢癌细胞系中表达降低，上调circRNA-ITCH可干扰miR-10a的表达，抑制卵巢癌细胞的增殖并促进细胞的凋亡。circRNA-ITCH可发挥明显的抑癌基因作用，然而其在鼻咽癌中的作用及机制尚不明确。

本研究结果显示，circRNA-ITCH在鼻咽癌组织和细胞系中低表达，表明circRNA-ITCH可能在鼻咽癌的发病过程中起到重要作用。CCK-8法和Transwell侵袭实验显示，过表达circRNA-ITCH可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭能力。10-11转位酶1(TET1)TET蛋白是体内存在的一种DNA去甲基化酶，可促进5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶，启动基因的去甲基化[17]。目前研究表明， TET1在鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌及卵巢癌等多种恶性肿瘤中表达明显降低，与肿瘤直径、肿瘤生长、肿瘤侵袭、临床分期等因素相关，TET1表达水平与肿瘤患者的预后有关，其表达越低，患者预后越差[18～20]。本研究结果显示，过表达circRNA-ITCH的CNE-2Z细胞中TET1在mRNA和蛋白水平的表达明显增加，表明circRNA-ITCH具有TET1基因的表达。有研究表明，TET1蛋白主要通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，发挥抑制肿瘤生长和转移的作用。本研究结果显示，TET1表达明显增加后，Wnt1、PLC、PKC和β-catenin蛋白表达明显降低，表明Wnt/β-catenin信号通路被抑制。

综上所述，circRNA-ITCH在鼻咽癌组织和细胞系中表达明显降低，过表达circRNA-ITCH可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭，其作用机制是促进TET1基因的表达，进一步抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化。circRNA-ITCH在鼻咽癌中表现为抑癌基因的作用，为鼻咽癌生物靶向治疗提供了实验依据。