lncRNA SCGB1B2P通过调控SPRY2基因表达对肾癌细胞增殖和侵袭的影响

鲁帅奇 李小辉 郝彤彤 韩兴涛 张 寒

肾癌是全世界泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，因其易转移、预后差，对其发生、发展的机制研究具有重要临床意义[1]。肾癌的发生包括抑癌基因失活、原癌基因激活等多种分子变化[2]。越来越多的研究显示，非编码RNA特别是长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在肾癌中具有重要调控作用[3]。lncRNA指转录本长度>200个核苷酸的非编码RNA，不能编码蛋白质，最初被认为是基因组转录的“噪声”[4]。近年来研究显示，lncRNA广泛参与基因组印迹、染色质修饰、X染色体沉默等多种细胞调控，与肾癌的发生、发展密切相关[5]。SCGB1B2P是一个尚未被报道研究的lncRNA，其在肾癌中的表达和作用机制亦不明确。本研究通过检测SCGB1B2P在肾癌组织和肾癌细胞株中的表达，分析SCGB1B2P与肾癌的发生、发展的相关性，通过体外细胞转染上调肾癌细胞中SCGB1B2P的表达，观察其对肾癌细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其作用机制。

材料与方法

1.材料：(1)细胞和主要试剂：肾癌细胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)和正常肾小管上皮细胞(HK-2)购自中国典型培养物保藏中心。表达SCGB1B2P的质粒和表达无意义序列的质粒购自苏州吉玛基因股份有限公司。RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司。转染试剂LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司。Transwell小室购自美国康宁公司。荧光实时定量PCR(qPCR)试剂盒购自天根生化科技有限公司；ECL显影液购自美国Thermo公司。噻唑蓝(methyl thiazol tetrazolium，MTT)试剂盒和二甲基亚砜购自南京凯基生物科技发展有限公司。Matrigel基质胶购自美国BD公司。一抗购自美国Cell Signaling Technology公司。二抗购自武汉博士德生物有限公司。(2)临床标本：选取2017年3月～2018年11月于郑州大学附属洛阳中心医院泌尿外科就诊并接受手术治疗的肾癌患者82例，患者平均年龄为45.8±11.87岁，收集术中肾癌组织标本及癌旁组织，所有标本均经病理学确诊。患者术前均未接受过放疗、化疗。本研究经笔者医院医学伦理学委员会审核并通过，患者均签署知情同意书。

2.细胞培养与转染：肾癌细胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，正常肾小管上皮细胞(HK-2)用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，于37℃、5% CO2的培养箱中培养。将OS-RC-2接种于6孔板中，随机分为实验组和对照组，根据LipofectamineTM3000 操作说明书操作，分别转染表达SCGB1B2P的质粒或表达无意义序列的质粒，保证lncRNA的终浓度为10nmol/L，转染12h后更换新鲜培养基。

3.qPCR检测：采用TRIzol法提取肾癌组织和细胞株总 RNA，采用反转录试剂盒反转录得到cDNA。以GAPDH为内参，采用qPCR试剂盒检测SCGB1B2P及SPRY2 mRNA 的表达水平， qPCR反应条件为：95℃ 3min，95℃ 20s，56℃ 15s，68℃ 15s，40个循环。GAPDH正向引物：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′；SPRY2正向引物：5′-CTCGGCCCAGAACGTGATT-3′，反向引物：5′-GGCAAA-AAGAGGGACATGACAC-3′；SCGB1B2P正向引物：5′-GTCGTGCAGCAACTGGAA-3′，反向引物：5′-CAGATTCTCATGGTTGGGACA-3′。荧光信号值采用2-ΔΔCt方法分析。

4.MTT法检测：将两组OS-RC-2细胞以4×103个/200μl的细胞密度接种于96孔板，培养1、2、3、4、5天后进行MTT法检测。检测时，每孔加入15μl MTT试剂，在37℃、5% CO2的培养箱孵育3h，每孔加入120μl二甲基亚砜，充分振荡，采用酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光度(A)值。

5.Matrigel实验：将Matrigel基质胶和无血清培养基按照1∶6比例稀释，每个上室加入60μl稀释液，在37℃、5% CO2的培养箱静置1h使胶凝固。将两组OS-RC-2细胞以4×104个/200微升的细胞密度接种于上室，下室加入600μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，培养36h后，取出上室，采用多聚甲醛固定40min，采用结晶紫染液染色20min，PBS溶液冲洗后，棉签轻轻擦去上层未侵袭的细胞。100倍显微镜下，随机选6个视野拍照并计数、统计。

6.Western blot法检测：将两组OS-RC-2细胞采用PBS溶液洗3遍后，加入高效细胞裂解液裂解细胞，提取细胞全蛋白。采用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，每孔蛋白上样量为30μg，电转法转移至NC膜。在5%脱脂牛奶中室温封闭120min，在一抗中4℃下孵育过夜，在二抗中室温下孵育 60min，采用ECL显影液曝光显影。

结 果

1.肾癌组织和癌旁组织中SCGB1B2P的表达水平：肾癌组织和癌旁组织中SCGB1B2P的表达水平分别为1.06±0.20和3.93±0.60，肾癌组织中SCGB1B2P表达水平均低于癌旁组织(P<0.01),详见图1。

2.肾癌细胞和正常肾小管上皮细胞中SCGB1B2P的表达水平：肾癌细胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)和正常肾小管上皮细胞(HK-2)中SCGB1B2P的表达水平分别为0.61±0.05、0.76±0.04、0.44±0.05、0.11±0.02、0.59±0.07和1.01±0.08，肾癌细胞系中SCGB1B2P表达水平均低于正常肾小管上皮细胞(P<0.05，图2)。OS-RC-2细胞中SCGB1B2P的表达水平最少(P<0.01)，故选择OS-RC-2细胞进行后续实验。

3.两组OS-RC-2细胞中SCGB1B2P的表达水平：转染48h后，收集两组OS-RC-2细胞，提取总RNA并进行qPCR检测SCGB1B2P的表达水平。实验组和对照组OS-RC-2细胞中SCGB1B2P表达水平分别为11.22±1.13和1.12±0.29，实验组明显高于对照组(P<0.01)。

4.上调SCGB1B2P抑制OS-RC-2细胞的增殖能力：MTT法检测两组OS-RC-2细胞的增殖能力，从第3天起，实验组细胞与对照组比较，增殖能力明显受到抑制(P<0.05，图3)。

5.上调SCGB1B2P抑制OS-RC-2细胞的侵袭能力：Matrigel实验检测两组OS-RC-2细胞的侵袭能力。实验组和对照组OS-RC-2细胞侵袭细胞数分别为30.85±5.79和87.26±10.02，与对照组比较，上调SCGB1B2P后明显抑制OS-RC-2细胞的侵袭能力，差异有统计学意义(P<0.01，图4)。

6.上调SCGB1B2P促进肾癌OS-RC-2细胞中SPRY2 mRNA的表达：qPCR检测两组OS-RC-2细胞SPRY2 mRNA的表达情况，实验组和对照组OS-RC-2细胞SPRY2 mRNA的表达分别为5.41±0.58和1.25±0.52， 上调SCGB1B2P能使SPRY2 mRNA表达水平升高(P<0.01)。

7. 上调SCGB1B2P促进肾癌OS-RC-2细胞中 SPRY2 蛋白表达：Western blot法检测结果显示，上调SCGB1B2P引起SPRY2蛋白表达升高，SPRY2蛋白表达升高后，造成Wnt/β-catenin信号通路蛋白如PP2A、GSK3及CK1α蛋白表达降低(图5)。

讨 论

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是RNA聚合酶Ⅱ转录的产物，通过转录抑制、转录激活等调控基因的表达，与细胞的分化、增殖、凋亡、衰老等各种活动密切相关[6]。lncRNA在肿瘤中的作用机制是近年来的研究热点，在结直肠癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤中均存在lncRNA的表达异常[7～9]。目前已发现的与肾癌有关的lncRNA包括ENST00000434223、ROR、KCNQ1DN、ITGB1等，在肾癌组织中表达上升或降低，参与调控肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭等能力，与肾癌患者的预后及复发相关[3,10～12]。lncRNA在肾癌中发挥重要作用，具有潜在的临床应用价值。SCGB1B2P长度为612个核苷酸，是一种在肿瘤包括肾癌中尚未被报道研究的lncRNA。本研究通过检测SCGB1B2P在肾癌组织和细胞中的表达水平，发现SCGB1B2P在肾癌组织和细胞中表达下调，提示SCGB1B2P可能参与肾癌的发生、发展。

MTT实验和Matrigel实验结果显示，上调SCGB1B2P可明显降低肾癌细胞的增殖能力和侵袭能力，SCGB1B2P在肾癌中可能发挥抑癌基因的功能。SPRY2(sprouty RTK signaling antagonist 2)蛋白是Sprouty家族蛋白之一，含315个氨基酸残基[13]。越来越多的研究表明，SPRY2在前列腺癌、胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤细胞中的表达被明显抑制，与肿瘤细胞异常的增殖和侵袭能力密切相关，SPRY2的低表达参与肿瘤的发生、发展[13～15]。SPRY2在肾癌组织中表达明显降低，SPRY2的表达水平与肾癌的不良预后呈负相关[16]。上调SPRY2的表达可抑制肾癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学行为，SPRY2蛋白已成为肾癌防治研究重点[16]。本研究通过上调肾癌细胞中SCGB1B2P的表达，SPRY2基因的表达水平明显增加，表明SCGB1B2P可明显促进SPRY2基因的表达。有研究表明，SPRY2通过抑制Wnt/β-catenin信号通路转导，负向调控细胞的生长和转移能力[17]。本研究结果表明，SPRY2基因表达降低后，Wnt/β-catenin信号转导通路蛋白如PP2A、GSK3及CK1α表达降低。SCGB1B2P调控SPRY2基因表达的具体作用机制尚不明确，这是本研究的不足之处。

综上所述，本研究证明了SCGB1B2P在肾癌中表达下调，高表达SCGB1B2P可抑制肾癌细胞的增殖和侵袭能力，其作用机制可能是SCGB1B2P促进SPRY2基因的表达。本研究对揭示肾癌发病机制具有重要意义，SCGB1B2P可能为肾癌的诊治提供了新的诊断标志物和治疗靶标。