FXR基因多态性与脓毒症的相关性研究

杨 晨 刘 瑜 陈阳希 郭 蕾 万文辉 赵玉生 王立群 黄 方

FXR属于核受体超家族成员之一，主要存在于在人体肝脏、肠道等器官中，在调节胆汁酸、脂质和葡萄糖平衡以及代谢等方面起着重要作用。此外，越来越多的证据表明FXR具有抗炎作用[1]。NF-κB (nuclear factor-κB)通路是炎症过程中的经典通路，可调节多种炎性细胞因子的转录表达。体内和体外脓毒症模型中NF-κB均高表达[2，3]。FXR激活后可通过干扰炎性转录因子NF-κB或AP-1(activator protein-1)的转录活性，抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL) -1β、IL-2、IL-6、IL-8等的表达，从而减轻炎性反应[4～6]。研究表明，在生理状态下将野生小鼠肠道内的FXR 基因敲除，小鼠肠道促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的mRNA 表达明显增加。脓毒症是重症监护病房患者发生急性肾损伤的重要原因，脂多糖在脓毒症发病中具有重要作用，预先给予FXR激动剂奥贝胆酸能减轻大鼠脂多糖诱导的肾脏炎症和氧化应激，从而缓解脓毒症相关的急性肾损伤[7]。脓毒症的发病还与某些基因的多态性相关，如TLR (Toll-like receptor)、IL-6、CD14、TNF-α和其他炎症相关的基因[8～10]。本文研究华北汉族人群中FXR基因中常见的SNP位点与脓毒症易感性和临床转归的相关性，为识别脓毒症高危患者诊提供依据。

资料与方法

1．基本资料：连续收集2011年6月～2012年6月中国人民解放军总医院急诊科收住的脓毒症患者，脓毒症的确诊参照2001年美国胸科医师学会(ACCP)和危重病医学会(SCCM)制定的脓毒症诊断和分级标准，同时收集体检中心的体检人员作为对照组[11]。纳入标准：①脓毒症诊断明确；②年龄≥18周岁；③籍贯为北京市及其周边地区(内蒙古自治区、天津市、山西省、河北省)的汉族人，相互之间无血缘关系；④病例资料和检验结果齐全。排除标准：①入院后24h内死亡；②患有AIDS、自身免疫性疾病、器官移植后、恶性肿瘤等其他特殊疾病；③存在重要器官功能衰竭及接受激素或免疫抑制剂治疗；④曾使用过TNF-α抗体、INF-γ等可调节炎症过程的细胞因子；⑤孕妇。收集所有入组患者的社会人口学资料、既往史、吸烟、饮酒史。同时还收集脓毒症患者实验室检验结果、感染部位及诊断脓毒症的基本指标、脓毒症24h内急性生理与慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ, APACHE Ⅱ)评分，采用Marshall标准计算住院期间最高MODS评分、临床结局[12]。本课题取得了中国人民解放军总医院医学伦理学委员会的批准，且全部入组者或其家属均签订了知情同意书。

2．方法：SNP位点的选择和基因分型在PubMed上检索FXR基因上与疾病相关的SNPs位点；然后通过NCBI的dbSNP数据库查找FXR基因功能区域(3′和5′非翻译区域、外显子)的SNPs位点；最后在HapMap数据库中选择北京汉族人口样本，并以r2>0.8为条件获取标签SNPs。在以上SNPs位点中，选取中国人群次要等位基因频率(minor allele frequency，MAF)大于10%的位点，最终得到rs103045411、rs10860598、rs10860603、rs11110411、rs17030270、rs17030295、rs2025801、rs35735、rs3762108、rs56163822、rs7960501共11个SNPs，其中rs3762108、rs56163822位于5′非编码功能位点，其余均位于内含子中。入组者静脉血DNA的提取使用德国QIAGENTM试剂盒；基因分型采用连接酶检测反应进行(上海天昊生物科技有限公司)。

结 果

1.脓毒症组与对照组的社会人口学资料和临床特征：共收集脓毒症患者310例和对照309例，最终符合条件的脓毒症患者和对照各为303例。脓毒症组平均年龄与对照组比较差异无统计学意义(59.35±18.79岁 vs 59.50±18.12岁，P=0.693)。其中脓毒症组男性187例(61.72%)，女性116例(38.28%)，与对照组男性169例(55.78%)，女性134例(44.22%)比较，差异无统计学意义(P=0.137)。与对照组比较，脓毒症组更多的合并慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)(6.93% vs 3.30%，P=0.043)。在303例脓毒症患者中，引起脓毒症的最常见的感染部位是肺部感染(180例，59.41%)，其次是腹腔内感染(83例，27.39%)、颅内感染(2例，0.66%)、泌尿系感染(3例，0.99%)、联合感染(25例，8.25%)和其他感染(10例，3.30%)。微生物培养结果显示，革兰阴性菌(85例，28.05%)感染是常见的感染类型，其次为革兰阳性菌感染(22例，7.26%)、真菌感染(18例，5.94%)、混合感染(76例，25.08%)及未见感染者(102例，33.66%)。器官功能障碍中呼吸系统是最常见的受累器官(172例，56.77%)，其次是循环系统(86例，28.38%)、肾脏(71例，23.43%)、肝脏(58例，19.14%)、中枢神经系统(49例，16.17%)及凝血系统(18例，5.94%)。诊断脓毒症后24h内患者APACHE Ⅱ评分为16.51±6.06分，MODS评分为6.11±3.09分。脓毒症患者发生脓毒性休克的有74例(24.42%)，重度器官功能障碍65例(21.45%)，住院期间死亡79例(26.07%)。

2.脓毒症临床转归特征比较：脓毒症患者中发生脓毒性休克74例(22.42%)，非休克229例(75.58%)。休克组患者平均年龄为66.38±18.21岁，明显高于非休克组患者的56.78±18.38岁(P=0.000)。休克组患者APACHE Ⅱ评分(21.62±5.34分 vs 14.80±5.20分)、MODS评分(9.03±2.90分 vs 5.13±2.47分)和病死率(86.49% vs 6.55%)明显高于非休克组(P=0.000)。重度器官功能障碍组患者APACHEⅡ评分(22.06±5.36分 vs 14.97±5.22分)和病死率(36.92% vs 23.11%)明显高于轻度器官功能障碍组患者(P=0.000)。死亡组患者平均年龄(66.63±17.24岁 vs 56.47±18.61岁)、APACHEⅡ评分(20.38±5.95分 vs 15.11±5.39分)和MODS评分(8.13±2.96分 vs 5.37±2.79分)明显高于存活组(P=0.000)。

3.FXR基因多态性与脓毒症易感性和临床转归的相关性：所有基因位点的频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在校正年龄、性别、BMI、吸烟饮酒状态、基础疾病的影响因素后，采用非条件Logistic回归分析显示，rs1030454 AG/AG+GG基因型发生脓毒症的风险较AA低[OR(95%CI)分别为0.66 (0.45～0.97)，P=0.036；0.69(0.47～0.99),P=0.046]，详见表1。rs56163822 TT较GG/GG+GT[9.77(1.40～68.15),P=0.022；9.23(1.34～63.57),P=0.04]，rs7960501 CC较TT/TT+CT[9.84(1.41～68.71),P=0.022；9.29(1.35～64.06),P=0.039]，rs17030270 GG较AA+AG[2.96(1.10～7.98),P=0.036]，rs1111041 CC较TT+TC[2.39(1.10～5.18),P=0.028]，rs17030295 TT较CC/CC+CT[10.30(1.48～71.90),P=0.019；9.29(1.35～64.06),P=0.039]，T较C[2.08(1.05～4.12),P=0.035],rs35735 TT较GG/GG+GT[3.10(1.03～9.36),P=0.048；3.67(1.27～10.57),P=0.019]发生重度器官功能障碍的风险高。rs1030454 AG+GG较AA[0.45(0.23～0.91),P=0.026]、G较A发生重度器官功能障碍的风险低[0.59(0.36～0.96),P=0.034]，详见表2。rs35735 GT/GT+TT较GG[2.21(1.18～4.13),P=0.015；2.17(1.19～3.96),P=0.01]、T较G[1.70(1.09～2.65),P=0.018]死亡风险增高，详见表3。未发现变异与脓毒性休克相关。

表1 FXR基因多态性与脓毒症易感性的相关性[n(%)]

表2 FXR基因多态性与器官功能障碍的相关性[n(%)]

续表2

表3 rs35735 FXR基因多态性与死亡的相关性[n(%)]

讨 论

脓毒症目前仍是世界范围内因感染死亡的最主要原因，其发病机制尚未完全阐明。近年来，一些代谢相关核受体，如过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)、肝脏X受体(liver X receptors, LXR)、FXR等的炎症保护作用引起了高度关注，可能成为感染性疾病和自身免疫性疾病治疗的新靶点[13～16]。既往在这一研究人群中发现，PPAR基因多态性与脓毒症易感性和重度器官功能障碍相关[17]。目前，还未见关于FXR基因多态性与脓毒症相关性的报道。

本研究在华北汉族人群中分析FXR基因上11个常见SNP位点与脓毒症的相关性，结果显示有7个SNP位点与脓毒症相关。rs1030454(A→G)能降低脓毒症和重度器官功能障碍的发生风险。rs35735 (G→T)发生重度器官功能障碍和死亡的风险升高。rs56163822 (G→T)、rs7960501(T→C)、rs17030270 (A→G)、rs11110411(T→C)、rs17030295(C→T)发生重度器官功能障碍的风险增高。尚未发现SNP位点与脓毒性休克存在相关性。

FXR基因11个SNP中，rs56163822和rs3762108是两个非编码功能位点，其他9个均位于内含子。FXR基因中非同义(non-synonymous)SNP罕见，提示FXR是遗传上非常保守的基因，对于维持器官功能和细胞稳态具有重要功能[18]。本研究中未发现rs3762108与脓毒症相关。阳性位点中rs56163822是位于FXR基因外显子3中、靠近转录起始位点的一个常见的、非编码功能多态。Liu等[19]曾指出中国人群中该位点突变率为14%，本研究对照组中该位点突变率为14.03%，与其相近。rs56163822的T 基因携带者相对于G/G 基因型个体肝脏中靶基因SHP 表达明显下降，而与另一靶基因BSEP 的表达则不相关，表明此位点对靶基因的表达的影响具有选择性[20]。Lut等[21]在白种人群中发现rs56163822 T能增加肝硬化腹腔积液患者自发性细菌性腹膜炎的发生风险。Kovacs等[22]研究结果提示在墨西哥男性人群中rs56163822 T对胆石症具有保护作用。而本研究中rs56163822 TT发生严重器官功能障碍的风险分别是GG和GG+GT的9.77倍和9.23倍，与脓毒症预后相关。研究表明，rs56163822(G→T)能够减少FXR mRNA翻译和降低对靶基因的转录功能[18]。而FXR不需要直接与靶基因结合，主要是通过干扰NF-κB、AP-1对靶基因的转录产生抗炎作用[4～6]。因此，推测rs56163822(G→T)通过减少FXR mRNA翻译和表达来影响脓毒症预后。本研究其他阳性位点(rs1030454、rs1111041、rs17030270、rs17030295、rs35735、rs7960501)均位于内含子中，且既往研究中较少报道。

综上所述，本研究首次在华北汉族人群中证明FXR基因上存在多个与脓毒症易感性和临床转归相关的SNPs位点，提示FXR基因多态性在脓毒症中具有重要作用。在基因水平的研究，可深度了解脓毒症复杂的发病机制，早期识别脓毒症高危患者，为脓毒症患者提供个性化治疗方案。未来还需扩大样本量、扩大研究人群，从而进一步验证所得结果，为脓毒症的诊疗提供新思路。