不同成肌诱导液对人尿源干细胞体外成肌分化的探究

李凤雯 姜之歆 王从容

间充质干细胞因其自我更新能力强，具备多向分化潜能，在组织工程学上的应用十分广泛[1～3]。2008年由Zhang等[4]首次从尿液中分离获得的一种具有多种分化潜能、符合间充质干细胞特征的人尿源干细胞(human urinary stem cells, hUSC)，尿液取材方便，安全无创，在基础研究中有一定的应用前景。hUSC具有成脂、成骨、成软骨的3系分化能力。既往研究显示特定诱导液能将hUSC分化成神经细胞，但是hUSC 定向成肌分化的能力尚不完全清楚[5]。为进一步确定hUSC的成肌分化能力，本研究结合既往文献，筛选以及调整成肌诱导液的相关成分，对hUSC进行定向成肌分化进行探索性研究。

对象与方法

1.对象：由3名成年男性健康志愿者留取尿液，留取过程符合上海市第六人民医院伦理学委员会规定。志愿者留取清洁中段尿液约200ml，用于后续提取。

2.方法：(1)hUSC分离和培养：留取无菌中段尿200ml后，加5ml青链霉素混匀后，超净工作台内分装至4支50ml无菌管。2000r/min离心10min后弃上清，加入20ml PBS依次清洗各管中的残余液体，吹打混匀后，再2000r/min离心10min。之后弃上清，用12ml培养基吹打混匀，将悬液加入预先用0.1%明胶包被的6孔板中，每孔2ml。最后，放入37℃，5% CO2培养箱中观察。每天观察细胞状态，直至克隆形成。待克隆团块融合至80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化，传代扩增。(2)hUSC表面标志物的鉴定：选取P5代人尿源干细胞, PBS 洗涤2遍,加0.25%胰蛋白酶将细胞消化下来,离心收取细胞。用1%牛血清白蛋白(BSA)洗涤后重悬细胞计数,调整细胞密度为106/ml。取细胞悬液 200μl加入藻红蛋白标记的单克隆抗体CD29、CD73、CD90、CD34,以及异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体 CD44、CD45 至各流式管,并以相应的光标记的IgG 抗体为同型对照组。冰上避光孵育30min, 孵育后 2000r/min离心5min,使用PBS清洗游离体,2000r/min 再次离心5min。最终用1% BSA 重悬细胞至 200μl,经Guava easyCyte(美国Millipore公司)流式细胞仪检测。(3)不同成肌诱导液的配置：A成肌诱导液：经典成骨诱导分化培养基+10μmol/L 5-氮杂胞苷(只处理前24h)[6]；B成肌诱导液：DMEM高糖完全培养基+10μmol/L 5-氮杂胞苷(只处理前24h)+0.1ng/ml MyoD+2ng/ml IGF-1+0.1ng/ml TGF-β3；C成肌诱导液：DF-12完全培养基+10μmol/L 5-氮杂胞苷(只处理前 24h)+0.1ng/ml MyoD+2ng/ml IGF-1+0.1ng/ml TGF-β3；D成肌诱导液：高糖DMEM+10% FBS+5%马血清+20μmol/L L-Glu+50μmol/L氢化可的松+0.1μmol/L地塞米松[7]。(4)成肌诱导分化：选取P5代hUSC，以5×104/ml接种在6孔板上，待细胞融合至90%，分别进行诱导分化。对照组不进行成肌诱导分化。诱导液每3天换1次,诱导至第28天,倒置显微镜下观察各诱导液中细胞形态变化。(5)诱导分化不同时间点成肌基因desmin和MyHC的mRNA表达水平测定：诱导第14天及第28天用PBS清洗细胞培养板，收取对应天数的细胞板。利用 TIANGEN总 RNA 提取试剂盒进行送检样品总 RNA 的提取，期间进行去 DNA 处理。利用TaKaRa Prime script RT reagent kit with gDNA Eraser(perfect real-time)试剂盒进行总RNA的反转录。反转录-聚合酶链反应参照 AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)反应体系, 最终由LightCycler 480 system测算CT值。引物定量标准依据内参 GAPDH。基因的引物序列Primer-BLAST 在线设计获得,由上海生物工程有限公司合成,正反向引物序列：GAPDH正向引物:5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3′,反向引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′；desmin正向引物:5′-ACCATCGCGGCTAAGAACAT-3′,反向引物:5′-AATCGGTCCTCCAATTCCCG-3′；MyHC正向引物:5′-CCGTCAGCACCGTGTCTT-3′,反向引物:5′-TGCGGATGAATTTGCCGAATC-3′。

结 果

1.hUSC细胞形态：正常人尿液沉渣细胞经hUSC完全培养基重悬后接种在六孔板上，次日观察是否污染。经过10天左右的观察，有米粒或是短梭形克隆出现，贴壁生长(图1A)。然后PBS清洗后，更换培养基。再经过3～4天的扩增生长，细胞克隆形成一个较大群落(图1B)，可进行胰酶消化传代，得到P1细胞。细胞经过多次传代后，细胞活性以及形态未发生明显改变。

2.流式细胞术检测hUSC表面标志物：P5代hUSC表面标志物鉴定结果见图2。CD29为99.8%，CD34为1.0%,CD44为99.8%,CD45为0.7%,CD73为99.9%, CD90为99.5%。符合间充质干细胞表面标志物特征。

3.hUSC在不同成肌诱导液诱导分化过程中的形态学变化：使用4种不同配制的诱导液成肌诱导28天后，细胞形态与未诱导时比较，出现以下变化(图3)。细胞间排列更紧密，hUSC由米粒或长梭形逐渐伸展变长，呈现肌细胞形态，可见肌管样细胞，其中经B和C成肌诱导液诱导的细胞，折光性更强，临近细胞相互融合，形成类似肌管样结构(图3中C、D)。

4.诱导分化不同时间点成肌基因结蛋白(desmin)和肌球蛋白重链(MyHC)的mRNA表达：成肌诱导分化第14天以及第28天时细胞desmin的表达量均较对照组显著上调(P<0.05)。第14天时，A、B、C 和 D 成肌诱导液中细胞 desmin基因表达水平分别是未分化状态下的3.03、4.19、3.23、1.28倍；成肌分化第28天，各成肌诱导液中细胞desmin基因表达水平的趋势与第14天基本一致，其中B成肌诱导液组较对照组增高6.43倍(图4A)。此外，4种成肌诱导液第14天及28天成肌分化中细胞MyHC基因表达均显著高于对照组(P<0.05)。第14天A、B、C 和 D 成肌诱导液成肌分化下细胞MyHC表达水平分别是对照组的13.08、16.03、31.54、7.93倍；第28天各组细胞中MyHC表达水平分别是对照组的22.93、107.91、191.98、10.65倍(图4B)。

讨 论

hUSC相较于其他来源的间充质干细胞，取材方便无创，有望成为细胞治疗的种子细胞[8]。然而 hUSC成肌分化的研究还不成熟，目前主要借助于市场上已有的用于其他干细胞的成肌诱导液。本研究利用4种不同成肌诱导液培养hUSC，观察其分化14天以及28天成肌特异基因表达。成肌基因表达产物包括肌源性标志蛋白desmin和MyHC。desmin为肌细胞的中间丝蛋白，正常分布于平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和肌上皮细胞，是肌细胞分化最早标志物。MyHC是肌球蛋白的基本组成单位，出现在肌细胞发育分化末期。本研究发现4种成肌诱导液诱导分化第14天，结蛋白的mRNA表达水平分别是对照组的3.03、4.19、3.23、1.28倍，其中B成肌诱导液中desmin显著表达。而分化末期即28天后，成肌诱导液分化下细胞MyHC mRNA表达水平是对照组的22.93、107.91、191.98、10.65倍。本研究未检测到成肌基因MyoD、Myogenin的基因表达，既往文献报道这两个基因在骨骼肌的表达量较低，无法检出或由于该基因本身的表达量较低。此外，成肌诱导28天后，经B和C成肌诱导液诱导的细胞，折光性更强，细胞有融合现象，类肌管样结构出现。整体而言，4种成肌诱导液均可诱导hUSC的成肌分化，B和C成肌诱导液在分化效果上优于另外两种。其中，C成肌诱导液终末分化效果最佳。

5-氮杂胞苷法是诱导细胞成肌分化的常见方法。其原理是阻止新复制DNA的胞嘧啶甲基化，激活原本转录失活的成肌基因[9]。研究表明10μmol/L的5-氮杂胞苷不仅可以控制药物本身对干细胞产生的毒性，还获得较高的成肌诱导率[10]。此外，细胞因子包括胰岛素样生长因1(IGF-1)、转化生长因子β(TGF-β)等都影响成肌分化。前者通过激活骨骼肌卫星细胞，增加PI3K水平，减少骨骼肌纤维化等提升成肌分化能力[11～14]。而TGF-β通过卫星细胞活化，调节免疫应答强度，从而参与肌肉修复的调节[15]。成肌调节因子MyoD作为骨骼肌细胞分化的开关基因，诱导的增强子RNA与hnRNPL相互作用，在成肌分化过程中激活靶基因转录，激活骨骼肌卫星细胞，促进成肌分化[16，17]。本研究采用了4种不同成分的成肌诱导液，A、B、C成肌诱导液均采用含10μmol/L 5-氮杂胞苷的完全培养基进行前24h的干预，B和C成肌诱导液中又都添加了细胞因子IGF-1、TGF-β、成肌调节因子MyoD，其分化完成后的成肌能力也更为明显。而D成肌诱导液则借助马血清和糖皮质激素诱导成肌分化。B和C成肌诱导液的最大不同主要在于B成肌诱导液采用DMEM高糖完全培养基而C成肌诱导液则选用DF-12完全培养基，DF-12培养基中营养成分更为丰富，或在分化期间更促进成肌进程。

综上所述，本研究利用不同成分的成肌诱导液对 hUSC进行成肌分化，结合细胞形态以及成肌特异基因表达，4种成肌诱导液在一定条件下均可将 hUSC分化成肌细胞，其中，C成肌诱导液效果更显著。目前尚需开展进一步的研究来验证 hUSC在成肌分化甚至细胞治疗上的价值。