基于网络药理学探究藏药二十五味松石丸治疗肝病的机制

史海熠，潘 安，杨欣彤，张 淼，牛 明，顾 健，赵 丹，史志龙*

（1.西南民族大学药学院，四川成都 610041； 2.解放军总医院第五医学中心全军中医药研究所，北京 100039； 3.昭通市第一人民医院药剂科，云南昭通 657000）

藏药二十五味松石丸是经典藏药名方，由著名的藏医名家宦仑扎哪创制，是藏区治疗肝胆疾病的最常用的成药之一。该方剂由松石、珍珠、牛黄、诃子等二十五味藏药按照藏医药理论经复杂炮制加工所得，现收载于《中国药典》 中［1］，方中木香、丁香行气止痛，牛黄、藏红花解毒化湿，诃子、天竺黄、马兜铃等有清热解毒的功能。近年研究表明，二十五味松石丸在治疗急、慢性肝损伤，肝纤维化，乙型肝炎等方面均有显著的疗效［2-4］。二十五味松石丸以“凉”性功效药物为主，可以平衡藏医理论中“三因”学“赤巴”型的热性，具有清热解毒、清肝胆热病的功效［5］，但目前关于它治疗肝病的作用机制方面的文献报道较少。

藏药组方复杂，成分多样，“多成分、多途径、多靶点”协同作用在复杂疾病的治疗上发挥着独特优势。但由于其物质基础和作用机制不明确，并且藏医理论与现代医学有明显区别，给藏医药现代研究带来很大的困难。网络药理学作为现代生物医药研究领域新兴的研究模式，目前已广泛应用在复方中药现代化研究中［6-8］。本研究采用该方法分析二十五味松石丸主要活性成分及潜在作用靶点，研究其对疾病网络的作用机理，进而探讨其治疗“赤巴”肝病的作用机制及应用规律。

1 方法

1.1 目标化合物筛选 由于二十五味松石丸组方复杂，课题组前期开展了组方规律研究及减方后药效对比研究，确定了核心配伍组分，结合TCMSP 数据库，并根据药材中化合物的专属性、类药性（分子量、生物利用率、口服吸收等参数） 及药理活性的相关报道，确定目标化合物，绘制三维结构文件用于以下研究。

1.2 目标化合物作用靶点预测 将目标化合物的三维结构文件通过Swiss Target Prediction 数据库 （http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／），应用基于蛋白组学的小分子探针对药物作用靶点进行蛋白筛选，获取与选取成分相关的信息。

1.3 靶点蛋白互作网络构建及功能模块注释分析 利用String 数据库（https：／ ／string-db.org／） 构建靶点蛋白间的相互作用 ［最低互分数 （minimum required interaction score） 为0.4］，生成蛋白之间物理交互和功能相关的互作网络。按照生物学功能的相关性提取蛋白质密集连接的网络，建立蛋白质紧密互作的子集，并对模块调控的相关功能进行描述。

1.4 GO 生物学功能注释分析 对二十五味松石丸的120个预测靶点进行生物功能分析，收集P＜0.01 者，最小计数为3，富集因子＞1.5 （富集因子是观测到的计数与随机期望计数之比），根据其隶属度相似性将其分组，得到GO、KEGG、Reactome 等通路的分析结果以及PPI 的富集结果。

1.5 二十五味松石丸活性成分-靶点-疾病生物网络的构建及分析 将二十五味松石丸有效活性成分作用的靶点蛋白通过Disgenet （http：／ ／www.disgenet.org／home／） 上的Summary of Gene-Disease Associations 数据库对六种常见肝病相关靶点进行映射，筛选治疗肝病的靶点。使用Cytoscape 3.7.1 软件构建成分-靶点蛋白-疾病相互作用网络模型，进行拓扑学分析，并对主要靶点作通路分析，预测药物针对肝病的通路和作用机制。

2 结果

2.1 二十五味松石丸主要活性成分筛选 参考课题组前期对二十五味松石丸药理活性及组方配伍规律的研究结果［5，9-10］，选择牛黄、诃子、檀香、降香、鸭嘴花、余甘子、木香、绿绒蒿、木香马兜铃、船形乌头、肉豆蔻、丁香、毛诃子、伞梗虎耳草、天竺黄、西红花、木棉花17 味药材。

筛选二十五味松石丸主要活性成分时，遵循按单味药物筛查的方式，优先选取主要活性成分、专属性成分、与肝病相关的成分，如牛黄中胆汁酸类和胆红素、毛诃子中没食子酸等［11-13］。结果，确定40 个目标化合物，见表1。

表1 二十五味松石丸目标化合物

2.2 构建PPI 互作网络和蛋白质功能模块注释分析 为了进一步探讨靶点蛋白之间的相互关系，将靶点蛋白导入String 数据库进行蛋白互作网络分析（图1），对调控相似通路的蛋白集群进行ID 着色。结果，靶点蛋白网络中包含19 个子网络，分别调控二氧化碳的可逆水合作用，蛋白质自磷酸化等通路。

图1 PPI 互作网络

对PPI 互作网络中联系紧密的子集进行聚类构建，建立出5 个子网络（图2），筛选出3 个可能性最高的生物功能信息作为每个子网络的功能描述，其生物学功能注释见表2。5 个靶点蛋白网络能够调控PI3K 信号通路，调节有丝分裂细胞周期的G2／M 过程，聚酮化合物代谢过程，葡萄糖代谢过程以及影响G 蛋白偶联受体。由此可以看出，二十五味松石丸作用靶点存在丰富的内部互作，可通过“多成分多靶点”特点对上述5 个生物功能产生明显的调控作用，使其临床应用范围有了拓展。

2.3 成分-靶点-疾病网络构建和分析 将化合物结构信息导入Swiss Target Prediction 数据库（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／） 进行靶点预测，选择与人类基因结合可能性≥30% 的蛋白作为成分作用靶点，共计120 个。从OMIM、Disgenet 等数据库中筛选常见肝病（包括肝癌、肝损伤、肝硬化、脂肪肝、肝肿大、乙型肝炎） 的基因、蛋白等靶点，对筛选的药物作用靶点进行映射。

图2 生物功能模块

将药物、化合物、靶点蛋白和疾病的相关信息导入Cytoscape 软件构建组分-作用靶点-疾病之间的相互作用网络图，见图3。牛黄、丁香、绿绒蒿、西红花、余甘子、木棉花、鸭嘴花、诃子、毛诃子九味药物通过120 个靶点作用于6 种肝病；不同组分可作用于相同的靶点，不同靶点之间又相互协调，共同调控肝病，体现了二十五味松石丸多成分、多靶点的作用特点。其中，对肝癌的作用靶点最多，其次是肝硬化、乙型肝炎，表明二十五味松石丸在治疗肝癌方面有着潜在的开发价值。肝硬化是很多慢性肝病发展过程中的阶段，存在多种病因［14］，在我国主要是乙型肝炎引起的肝硬化［15］。通过对疾病靶点的筛查发现，二十五味松石丸对肝纤维化和肝损伤的作用靶点较少，与乙型肝炎靶点匹配结果较好，即仅对感染性肝病，尤其是乙型肝炎所引起的肝硬化有治疗效果。

表2 功能模块生物学功能注释

图3 组分-靶点-疾病网络图

Degree 表示和节点相连的线数目，代表该节点在整个网络中的重要性，本实验筛选网络中Degree ≥Average Degree 的47 个核心节点，包括 AKT1、EGFR、SRC、MMP9、KDR 等（表3）。越来越多的研究表明，许多实体肿瘤中存在EGFR 的高表达［16］，此外MMP-2、MMP-9 这2个靶点还参与肝癌细胞对组织的侵袭转移过程［17］。

对药味进行网络拓扑学分析，发现结合靶点最多的是绿绒蒿、毛诃子、西红花3 味药物，见表4～5。课题组对二十五味松石丸配伍特点的前期研究表明，包括绿绒蒿、毛诃子在内的11 种“涩”味药、以牛黄为首的7 种“苦”味药、以西红花为首的3 种“甘”味药主要用于治疗“赤巴”的热性疾病，起到了清肝、胆热的功效。在《藏汉合璧常用藏成药使用手册》 《新修晶珠本草》 《四部医典》《藏药与方剂》 中整理得到的21 种治疗肝病的常用藏药方剂中，使用频率最高的为西红花和牛黄［5］，为传统藏医理论中的“主”药，同时其他几味“仆”药作用于部分靶点，对二十五味松石丸整体治疗各类肝病做出了贡献［18］。

2.4 基因功能和通路分析 将二十五味松石丸对肝病的120 个潜在作用靶点通过Metascape 网站进行GO 生物功能注释［19］，筛选P值排名前20 的通路，见图4、表6。其中，壳聚糖代谢过程（icosanoid metabolic process） 所代表的是任何一组碳二十不饱和脂肪酸中的化学反应和途径，而PID PTP1B pathway 是参与调控蛋白酪氨酸磷酸酶1B 的通路，该通路可抑制脂肪肝的发生。此外，还包括脂质代谢（metabolism of lipids）、EGFR-TKI 耐药（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance） 等18 条通路。

表3 关键靶点及其拓扑学参数（前10 位）

表4 组分拓扑学参数

表5 疾病拓扑学参数

3 讨论

二十五味松石丸为藏医经典成方，是藏医治疗各类肝病的常用药物，由于藏医药现代研究薄弱，藏医药理论与现代医学有着较大差异，临床应用范围不明确，作用机制不清，严重阻碍了临床应用及疗效的稳定发挥。本研究采用网络药理学方法，探讨二十五味松石丸在肝病治疗上应用规律及可能的作用机制及药效物质基础。研究结果表明，二十五味松石丸中九味成分作用于6 种常见肝病的120 个靶点，可以对肝癌、乙型病毒性肝炎和肝硬化等常见肝病的靶点产生调控作用，明确了二十五味松石丸临床应用范围。

图4 KEGG 通路富集分析

在进一步对潜在作用靶点分析过程中发现，二十五味松石丸部分目标化合物参与壳聚糖代谢过程，促进壳聚糖水解生成WCS 和COS，有报道显示壳聚糖及其衍生物具有防治药物性肝损伤的作用［20］。此外，二十五位松石丸调控PID PTP1B 通路从而影响胰岛素信号转导，有研究显示该通路与脂肪肝的发生有着密切的联系［21］。另外通路富集分析中发现EGFR 通路为二十五味松石丸关键通路，有研究表明EGFR 与肿瘤细胞黏附、增殖、转移以及肿瘤新血管的生成有关［22］，这显示出二十五味松石丸具有潜在肿瘤药物开发价值。

综上所述，本研究通过网络药理学方法建立肝病靶点，并构建组分-靶点-疾病作用关系网络，对二十五味松石丸的作用靶点、通路进行了系统性分析，初步阐释了该方作用机制，可为其后续研究提供思路。

表6 GO 分析