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黄芩酒炙工艺的优化及其抗炎活性

2020-08-04贺素容杜远东王晶张景霞吴博吴建华王昌利赵重博

中成药 2020年7期
关键词:投药黄酒黄芩

贺素容 杜远东王 晶张景霞吴 博吴建华王昌利赵重博*

(1.陕西中医药大学,陕西咸阳 712046; 2.陕西省中药饮片工程技术研究中心,陕西咸阳 712046;3.汉中市食品药品检验检测中心,陕西汉中 723000)

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根,其性寒,味苦,归肺、胆、脾、大肠、小肠经[1-2],功效清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎,常用于治疗湿温、暑湿、胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高热烦渴、血热吐衄、痈肿疮毒、胎动不安。其主要成分为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类,具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、心血管保护、镇痛、保肝等药理作用[3-6]。

2015 年版《中国药典》 中黄芩饮片类型有生黄芩、酒黄芩2 种,该药材酒炙后入血分,可借黄酒升腾之力上行,用于上焦肺热及四肢肌表之湿热,同时酒性大热,可缓和苦寒之性。因此,黄芩炮制品也有很好的临床疗效,并且不同酒炙工艺会产生质量差异,从而影响其效果。

一直以来,中药炮制技术就有着机制不明确、工艺粗糙等问题,同时炮制过程也会受很多主观因素的影响,导致难以把控饮片质量[7-10]。本实验将优化黄芩酒炙工艺,考察主要指标成分含有量的变化,并建立大鼠炎症模型来探索酒炙对该药材药效的影响,以期为其炮制工艺建立提供数据支持。

1 材料

FA2004N 型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);KH-400-KDE 型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Waters 高效液相色谱仪(配置Waters-2695 检测器、Empower Pro 化学工作站);0.22 μm 微孔滤膜[杉羽(天津) 科技发展有限公司];DT8380 型红外测温仪(深圳查尔孟科技有限公司);198 型中药参茸切药机(兆申兴盛有限公司);WK-800A 型高速药物粉碎机(青州市精诚机械有限公司);101 型电热鼓风干燥机(上海科恒实业发展有限公司);PV-200型足肿胀测定仪(成都泰盟科技有限公司)。

黄芩购于陕西兴盛德药业有限责任公司,经陕西中医药大学王昌利教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根。黄芩苷(批号110715-201720)、汉黄芩苷(批号B20488)、黄芩素 (批号110595-201607)、汉黄芩素 (批号111514-201605) 对照品均购自中国食品药品检定研究院。市售绍兴黄酒(乙醇14.5%)。乙腈、甲醇为色谱纯;95%乙醇、甲醇、磷酸为分析纯;水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 酒黄芩制备 参考文献[9]报道结合实际操作,初步拟定制备方法为称取黄芩50 g,加15%黄酒拌匀后闷润20 min,在120 ℃投药温度下炒炙10 min,取出,晾凉,即得。

2.2 各成分含有量测定

2.2.1 色谱条件 Ultimate® XB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相乙腈-0.1% 磷酸,梯度洗脱(0~15 min,15%~25%乙腈;15~31 min,25%~55%乙腈;31~40 min,55%~65%乙腈);体积流量1 mL/min;检测波长275 nm;进样量30 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品各20 mg,黄芩苷对照品40 mg,置于10 mL 量瓶中,甲醇超声溶解并定容至刻度,得到贮备液,各吸取1 mL 至25 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,即得(黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素质量浓度均为0.050 mg/mL,黄芩苷质量浓度为0.100 mg/mL)。

2.2.3 供试品溶液制备 取酒黄芩粉末约0.3 g,精密称定,加入70% 乙醇40 mL,加热回流提取3 h,放冷,滤过,滤液置于100 mL 量瓶中,少量70%乙醇多次洗涤容器和残渣,洗液合并到同一量瓶中,70%乙醇定容至刻度,摇匀,精密移取1 mL于10 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,摇匀,即得。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取 “2.2.2”项下贮备液,甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为0.100 0、0.050 0、0.025 0、0.016 7、0.012 5、0.001 mg/mL,黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素质量浓度均为0.050 0、0.025 0、0.012 5、0.008 3、0.006 3、0.005 0 mg/mL 的溶液,在“2.2.1”项色谱条件下进样30 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,得方程分别为黄芩苷Y=27 100X+6 689 (R2=0.999 5)、汉黄芩苷Y=61 658X+19 078 (R2=0.999 4)、黄芩素Y=25 979X+8 832 (R2=0.999 4)、汉黄芩素Y=47 785X+8 658 (R2=0.999 7),分别在1.000 0~100.000 0、5.000 0~50.000 0、5.000 0~ 50.000 0、5.000 0~50.000 0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液,在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6 次,每次30 μL,测得黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素峰面积RSD 分别为1.02%、0.73%、0.39%、1.02%,表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取酒黄芩粉末适量,按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.2.1”项色谱条件下进样测定,测得黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素峰面积RSD 分别为0.83%、1.11%、0.98%、1.01%,表明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液,于0、2、4、6、12、24 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定2 次,每次30 μL,测得黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素峰面积RSD 分别为1.07%、0.21%、0.48%、0.98%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素质量浓度已知(0.103、0.125、0.087、0.054 mg/mL) 的酒黄芩粉末6份,每份0.30 g,置于同一10 mL 量瓶中,加入“2.2.2”项下对照品溶液1.5 mL,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,在“2.2.1”项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素平均加样回收率分别为102.3%、99.7%、101.5%、98.9%,RSD 分别为1.70%、2.21%、1.48%、3.46%。

2.3 醇溶性浸出物含有量测定 参照2015 年版《中国药典》 一部[11]醇溶性浸出物测定法(通则2201) 项下的热浸法进行测定,以稀乙醇为溶剂。

2.4 单因素试验 在2015 年版《中国药典》 酒黄芩质量标准中,仅有黄芩苷含有量测定,故本实验以其为评价指标。

2.4.1 加酒量 称取黄芩饮片5 份,每份50 g,加5%、10%、15%、20%、25% 黄酒拌匀后闷润20 min,置于容器中,在120 ℃投药温度下炒炙10 min,取出,晾凉(加20%、25%黄酒时不能完全吸干),测定黄芩苷含有量,结果见图2。由此可知,黄芩苷含有量随着加酒量增加而升高,但超过10%后其升高程度趋缓,故确定加酒量为10%。

2.4.2 闷润时间 称取黄芩饮片5 份,每份50 g,加10%黄酒拌匀后闷润10、20、30、40、50 min,置于容器中,在120 ℃投药温度下炒炙10 min,取出,晾凉(闷润10 min 时切开断面未润透),测定黄芩苷含有量,结果见图2。由此可知,闷润30 min时黄芩苷含有量最高,但继续延长后其变化不明显,故确定闷润时间为30 min。

2.4.3 投药温度 称取黄芩饮片5 份,每份50 g,加10%黄酒拌匀后闷润30 min,置于容器中,在80、100、120、140、160 ℃下炒炙10 min,取出,晾凉,测定黄芩苷含有量,结果见图2。由此可知,投药温度120 ℃时黄芩苷含有量最高,但继续提高后其反而降低,故确定投药温度为120 ℃。

2.4.4 炒炙时间 称取黄芩饮片5 份,每份50 g,加10%黄酒拌匀后闷润30 min,置于容器中,在120 ℃投药温度下炒炙5、10、15、20、25 min,取出,晾凉(炒炙5 min 时黄芩未完全炒干),测定黄芩苷含有量,结果见图2。由此可知,炒炙15 min时黄芩苷含有量最高,但继续延长后其反而降低,故确定炒炙时间为15 min。

2.5 Plackett-Burman 设计 在单因素试验基础上,通过Design-Expert 10.0 软件进行Plackett-Burman设计[12-14],选择加酒量(A)、闷润时间(B)、投药温度(C)、炒炙时间(D) 作为影响因素,设置2 个水平(-1、1);黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、醇溶性浸出物含有量作为评价指标,Hassan 法[15]测定其“归一值”(d),再计算总评“归一值”(OD),公式为OD= (d1d2…dk)1/k,其中k为指标数,因素水平见表1,结果见表2,方差分析见表3。由此可知,各因素影响程度依次为炒炙时间(D) >加酒量(A) >投药温度(C) >闷润时间(B),其中前3 个因素有显著影响(P<0.05),而因素B影响不显著(P>0.05)。结合单因素试验,确定闷润时间为30 min。

图2 各因素对黄芩苷含有量的影响Fig.2 Effects of various factors on baicalin content

表1 Plackett-Burman 设计因素水平Tab.1 Factors and levels for Plackett-Burman design

2.6 Box-Behnken 响应面法 根据单因素试验、Plackett-Burman 设计结果,选择加酒量(A)、投药温度(C)、炒炙时间(D) 作为影响因素,设置3 个水平(-1、0、1);黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、醇溶性浸出物含有量作为评价指标,按“2.5”项下方法计算OD值,因素水平见表4,结果见表5。

通过Design-Expert 10.0 软件将表5 数据进行二项式拟合,得到方程为OD=0.69 +0.068A-0.082C+0.10D-0.16AC+0.070AD+8.028×10-3CD-0.12A2-0.41C2-0.073D2(R2=0.994 9),方差分析见表6,可知模型拟合情况良好(P<0.01),可用于预测。响应面分析见图3。

由此得到,最优工艺为加酒量9.693%,闷润时间30 min,投药温度127.217 ℃,炒炙时间17.217 min 时,结合实际情况,将其修正为加酒量10%,闷润时间30 min,投药温度127 ℃,炒炙时间17 min,OD值0.78。按照上述优化工艺进行3批验证试验,结果见表7,可知工艺稳定可行,适合实际需求。

表2 Plackett-Burman 设计方案与结果Tab.2 Schemes and results of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman 设计方差分析Tab.3 Analysis of variance for Plackett-Burman design

表4 Box-Behnken 响应面法因素水平Tab.4 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表5 Box-Behnken 响应面法方案和结果Tab.5 Schemes and results of Box-Behnken response surface method

表6 Box-Behnken 响应面法方差分析Tab.6 Analysis of variance for Box-Behnken response surface method

2.7 抗炎活性研究 30 只SD 大鼠适应性喂养7 d后随机分为模型组、生品组、酒炙品组,每组10只。称定质量后,模型组大鼠灌胃给予生理盐水(10 mL/kg),其他2 组大鼠灌胃给予相应提取物混悬液(6 g/kg,按生药量算)[16],每天1 次,连续8 d。最后1 次灌胃结束1 h 后,各组大鼠右足趾部皮下注射1%角叉菜胶溶液0.1 mL 致炎,标记右足测量部位,于致炎前及致炎后1、2、3、4、5 h采用足肿胀测定仪测定右足厚度,参考文献[17]报道的方法计算足肿胀度,公式为足肿胀度=致炎后足厚度-致炎前足厚度。通过SPSS 19.0 软件进行处理,数据以() 表示,多组间比较采用单因素方差分析,结果见表8。

3 讨论

黄芩是典型的清热燥湿药,中医认为其药性苦寒而能燥湿泄热,但易伤及人体正气,故临床上大多用黄酒炮制,既以黄酒热性缓和黄芩苦寒之性,又利用黄酒易入血分的特点增强黄芩清热作用。现代研究更注重炮制过程中化学成分的变化,黄芩苷具有邻二酚羟基结构,易随温度升高而加速氧化降解进程,是黄芩发挥抗炎活性的关键物质基础,其含有量随着炒制时间延长呈先升后降的趋势,与熊优等[7]报道一致,而且炒炙时间是黄芩酒炙过程中最主要的影响因素。

图3 各因素响应面图Fig.3 Response surface plots for various factors

表7 验证试验结果(n=3)Tab.7 Results of verification tests (n=3)

本实验采用Plackett-Burman 设计结合Box-Behnken响应面法优化黄芩酒炙工艺,相比于正交实验,上述方法可连续地对各水平进行分析,而且结果更直观准确[18]。再考察了检测波长 (275、280 nm)、流动相系统(乙腈-0.1%磷酸等度洗脱、梯度洗脱)、进样量(10、20、30 μL)[19],发现在275 nm 波长下进样30 μL,以乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱时,色谱峰基线平稳,各成分峰面积高,分离度良好。

表8 3 组大鼠足肿胀度(mL,, n=10)Tab.8 Paw swelling degrees of rats in three groups (mL,, n=10)

表8 3 组大鼠足肿胀度(mL,, n=10)Tab.8 Paw swelling degrees of rats in three groups (mL,, n=10)

注:与模型组比较,#P<0.05;与生品组比较,▲P<0.05。

角叉菜胶致大鼠足肿胀实验结果表明,黄芩具有较好的抗炎活性,经酒炙后可进一步增强,符合黄芩酒炙增效这一传统观点。有研究表明,黄芩的抗炎活性是黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等多成分共同作用的结果[20],可能与优化工艺中酒炙黄芩所含上述成分含有量较高有关,具体有待进一步研究。

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