黄芩酒炙工艺的优化及其抗炎活性

贺素容 杜远东王 晶张景霞吴 博吴建华王昌利赵重博*

（1.陕西中医药大学，陕西咸阳 712046； 2.陕西省中药饮片工程技术研究中心，陕西咸阳 712046；3.汉中市食品药品检验检测中心，陕西汉中 723000）

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，其性寒，味苦，归肺、胆、脾、大肠、小肠经［1-2］，功效清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎，常用于治疗湿温、暑湿、胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高热烦渴、血热吐衄、痈肿疮毒、胎动不安。其主要成分为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、心血管保护、镇痛、保肝等药理作用［3-6］。

2015 年版《中国药典》 中黄芩饮片类型有生黄芩、酒黄芩2 种，该药材酒炙后入血分，可借黄酒升腾之力上行，用于上焦肺热及四肢肌表之湿热，同时酒性大热，可缓和苦寒之性。因此，黄芩炮制品也有很好的临床疗效，并且不同酒炙工艺会产生质量差异，从而影响其效果。

一直以来，中药炮制技术就有着机制不明确、工艺粗糙等问题，同时炮制过程也会受很多主观因素的影响，导致难以把控饮片质量［7-10］。本实验将优化黄芩酒炙工艺，考察主要指标成分含有量的变化，并建立大鼠炎症模型来探索酒炙对该药材药效的影响，以期为其炮制工艺建立提供数据支持。

1 材料

FA2004N 型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；KH-400-KDE 型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Waters 高效液相色谱仪（配置Waters-2695 检测器、Empower Pro 化学工作站）；0.22 μm 微孔滤膜［杉羽（天津） 科技发展有限公司］；DT8380 型红外测温仪（深圳查尔孟科技有限公司）；198 型中药参茸切药机（兆申兴盛有限公司）；WK-800A 型高速药物粉碎机（青州市精诚机械有限公司）；101 型电热鼓风干燥机（上海科恒实业发展有限公司）；PV-200型足肿胀测定仪（成都泰盟科技有限公司）。

黄芩购于陕西兴盛德药业有限责任公司，经陕西中医药大学王昌利教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根。黄芩苷（批号110715-201720）、汉黄芩苷（批号B20488）、黄芩素 （批号110595-201607）、汉黄芩素 （批号111514-201605） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。市售绍兴黄酒（乙醇14.5%）。乙腈、甲醇为色谱纯；95%乙醇、甲醇、磷酸为分析纯；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 酒黄芩制备 参考文献［9］报道结合实际操作，初步拟定制备方法为称取黄芩50 g，加15%黄酒拌匀后闷润20 min，在120 ℃投药温度下炒炙10 min，取出，晾凉，即得。

2.2 各成分含有量测定

2.2.1 色谱条件 Ultimate® XB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1% 磷酸，梯度洗脱（0～15 min，15%～25%乙腈；15～31 min，25%～55%乙腈；31～40 min，55%～65%乙腈）；体积流量1 mL／min；检测波长275 nm；进样量30 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品各20 mg，黄芩苷对照品40 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇超声溶解并定容至刻度，得到贮备液，各吸取1 mL 至25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得（黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素质量浓度均为0.050 mg／mL，黄芩苷质量浓度为0.100 mg／mL）。

2.2.3 供试品溶液制备 取酒黄芩粉末约0.3 g，精密称定，加入70% 乙醇40 mL，加热回流提取3 h，放冷，滤过，滤液置于100 mL 量瓶中，少量70%乙醇多次洗涤容器和残渣，洗液合并到同一量瓶中，70%乙醇定容至刻度，摇匀，精密移取1 mL于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取 “2.2.2”项下贮备液，甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为0.100 0、0.050 0、0.025 0、0.016 7、0.012 5、0.001 mg／mL，黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素质量浓度均为0.050 0、0.025 0、0.012 5、0.008 3、0.006 3、0.005 0 mg／mL 的溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样30 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程分别为黄芩苷Y＝27 100X＋6 689 （R2＝0.999 5）、汉黄芩苷Y＝61 658X＋19 078 （R2＝0.999 4）、黄芩素Y＝25 979X＋8 832 （R2＝0.999 4）、汉黄芩素Y＝47 785X＋8 658 （R2＝0.999 7），分别在1.000 0～100.000 0、5.000 0～50.000 0、5.000 0～ 50.000 0、5.000 0～50.000 0 μg／mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6 次，每次30 μL，测得黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素峰面积RSD 分别为1.02%、0.73%、0.39%、1.02%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取酒黄芩粉末适量，按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素峰面积RSD 分别为0.83%、1.11%、0.98%、1.01%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定2 次，每次30 μL，测得黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素峰面积RSD 分别为1.07%、0.21%、0.48%、0.98%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素质量浓度已知（0.103、0.125、0.087、0.054 mg／mL） 的酒黄芩粉末6份，每份0.30 g，置于同一10 mL 量瓶中，加入“2.2.2”项下对照品溶液1.5 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素平均加样回收率分别为102.3%、99.7%、101.5%、98.9%，RSD 分别为1.70%、2.21%、1.48%、3.46%。

2.3 醇溶性浸出物含有量测定 参照2015 年版《中国药典》 一部［11］醇溶性浸出物测定法（通则2201） 项下的热浸法进行测定，以稀乙醇为溶剂。

2.4 单因素试验 在2015 年版《中国药典》 酒黄芩质量标准中，仅有黄芩苷含有量测定，故本实验以其为评价指标。

2.4.1 加酒量 称取黄芩饮片5 份，每份50 g，加5%、10%、15%、20%、25% 黄酒拌匀后闷润20 min，置于容器中，在120 ℃投药温度下炒炙10 min，取出，晾凉（加20%、25%黄酒时不能完全吸干），测定黄芩苷含有量，结果见图2。由此可知，黄芩苷含有量随着加酒量增加而升高，但超过10%后其升高程度趋缓，故确定加酒量为10%。

2.4.2 闷润时间 称取黄芩饮片5 份，每份50 g，加10%黄酒拌匀后闷润10、20、30、40、50 min，置于容器中，在120 ℃投药温度下炒炙10 min，取出，晾凉（闷润10 min 时切开断面未润透），测定黄芩苷含有量，结果见图2。由此可知，闷润30 min时黄芩苷含有量最高，但继续延长后其变化不明显，故确定闷润时间为30 min。

2.4.3 投药温度 称取黄芩饮片5 份，每份50 g，加10%黄酒拌匀后闷润30 min，置于容器中，在80、100、120、140、160 ℃下炒炙10 min，取出，晾凉，测定黄芩苷含有量，结果见图2。由此可知，投药温度120 ℃时黄芩苷含有量最高，但继续提高后其反而降低，故确定投药温度为120 ℃。

2.4.4 炒炙时间 称取黄芩饮片5 份，每份50 g，加10%黄酒拌匀后闷润30 min，置于容器中，在120 ℃投药温度下炒炙5、10、15、20、25 min，取出，晾凉（炒炙5 min 时黄芩未完全炒干），测定黄芩苷含有量，结果见图2。由此可知，炒炙15 min时黄芩苷含有量最高，但继续延长后其反而降低，故确定炒炙时间为15 min。

2.5 Plackett-Burman 设计 在单因素试验基础上，通过Design-Expert 10.0 软件进行Plackett-Burman设计［12-14］，选择加酒量（A）、闷润时间（B）、投药温度（C）、炒炙时间（D） 作为影响因素，设置2 个水平（-1、1）；黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、醇溶性浸出物含有量作为评价指标，Hassan 法［15］测定其“归一值”（d），再计算总评“归一值”（OD），公式为OD＝ （d1d2…dk）1／k，其中k为指标数，因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。由此可知，各因素影响程度依次为炒炙时间（D） ＞加酒量（A） ＞投药温度（C） ＞闷润时间（B），其中前3 个因素有显著影响（P＜0.05），而因素B影响不显著（P＞0.05）。结合单因素试验，确定闷润时间为30 min。

图2 各因素对黄芩苷含有量的影响Fig.2 Effects of various factors on baicalin content

表1 Plackett-Burman 设计因素水平Tab.1 Factors and levels for Plackett-Burman design

2.6 Box-Behnken 响应面法 根据单因素试验、Plackett-Burman 设计结果，选择加酒量（A）、投药温度（C）、炒炙时间（D） 作为影响因素，设置3 个水平（-1、0、1）；黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、醇溶性浸出物含有量作为评价指标，按“2.5”项下方法计算OD值，因素水平见表4，结果见表5。

通过Design-Expert 10.0 软件将表5 数据进行二项式拟合，得到方程为OD＝0.69 ＋0.068A-0.082C＋0.10D-0.16AC＋0.070AD＋8.028×10-3CD-0.12A2-0.41C2-0.073D2（R2＝0.994 9），方差分析见表6，可知模型拟合情况良好（P＜0.01），可用于预测。响应面分析见图3。

由此得到，最优工艺为加酒量9.693%，闷润时间30 min，投药温度127.217 ℃，炒炙时间17.217 min 时，结合实际情况，将其修正为加酒量10%，闷润时间30 min，投药温度127 ℃，炒炙时间17 min，OD值0.78。按照上述优化工艺进行3批验证试验，结果见表7，可知工艺稳定可行，适合实际需求。

表2 Plackett-Burman 设计方案与结果Tab.2 Schemes and results of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman 设计方差分析Tab.3 Analysis of variance for Plackett-Burman design

表4 Box-Behnken 响应面法因素水平Tab.4 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表5 Box-Behnken 响应面法方案和结果Tab.5 Schemes and results of Box-Behnken response surface method

表6 Box-Behnken 响应面法方差分析Tab.6 Analysis of variance for Box-Behnken response surface method

2.7 抗炎活性研究 30 只SD 大鼠适应性喂养7 d后随机分为模型组、生品组、酒炙品组，每组10只。称定质量后，模型组大鼠灌胃给予生理盐水（10 mL／kg），其他2 组大鼠灌胃给予相应提取物混悬液（6 g／kg，按生药量算）［16］，每天1 次，连续8 d。最后1 次灌胃结束1 h 后，各组大鼠右足趾部皮下注射1%角叉菜胶溶液0.1 mL 致炎，标记右足测量部位，于致炎前及致炎后1、2、3、4、5 h采用足肿胀测定仪测定右足厚度，参考文献［17］报道的方法计算足肿胀度，公式为足肿胀度＝致炎后足厚度-致炎前足厚度。通过SPSS 19.0 软件进行处理，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，结果见表8。

3 讨论

黄芩是典型的清热燥湿药，中医认为其药性苦寒而能燥湿泄热，但易伤及人体正气，故临床上大多用黄酒炮制，既以黄酒热性缓和黄芩苦寒之性，又利用黄酒易入血分的特点增强黄芩清热作用。现代研究更注重炮制过程中化学成分的变化，黄芩苷具有邻二酚羟基结构，易随温度升高而加速氧化降解进程，是黄芩发挥抗炎活性的关键物质基础，其含有量随着炒制时间延长呈先升后降的趋势，与熊优等［7］报道一致，而且炒炙时间是黄芩酒炙过程中最主要的影响因素。

图3 各因素响应面图Fig.3 Response surface plots for various factors

表7 验证试验结果（n＝3）Tab.7 Results of verification tests （n＝3）

本实验采用Plackett-Burman 设计结合Box-Behnken响应面法优化黄芩酒炙工艺，相比于正交实验，上述方法可连续地对各水平进行分析，而且结果更直观准确［18］。再考察了检测波长 （275、280 nm）、流动相系统（乙腈-0.1%磷酸等度洗脱、梯度洗脱）、进样量（10、20、30 μL）［19］，发现在275 nm 波长下进样30 μL，以乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱时，色谱峰基线平稳，各成分峰面积高，分离度良好。

表8 3 组大鼠足肿胀度（mL，， n＝10）Tab.8 Paw swelling degrees of rats in three groups （mL，， n＝10）

表8 3 组大鼠足肿胀度（mL，， n＝10）Tab.8 Paw swelling degrees of rats in three groups （mL，， n＝10）

注：与模型组比较，＃P＜0.05；与生品组比较，▲P＜0.05。

角叉菜胶致大鼠足肿胀实验结果表明，黄芩具有较好的抗炎活性，经酒炙后可进一步增强，符合黄芩酒炙增效这一传统观点。有研究表明，黄芩的抗炎活性是黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等多成分共同作用的结果［20］，可能与优化工艺中酒炙黄芩所含上述成分含有量较高有关，具体有待进一步研究。