一测多评法同时测定穿黄片、穿黄胶囊中10 种成分

郭海姣，覃洁萍*，刘 雯，梁梓敏，陈文洁，罗宇东

（1.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001； 2.广西中医药大学附属制药厂，广西南宁 530023）

穿黄制剂由穿心莲、一枝黄花2 味药材组成，具有清热解毒的功效，临床上用于治疗急性上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽喉炎等疾病［1］。其中，穿心莲提取物的有效成分主要为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯，具有解热、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用［2-3］；一枝黄花提取物含有多种咖啡酰奎宁酸类成分，包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸及异绿原酸A、B、C，均具有抗炎解热、抗菌抗病毒、祛痰平喘等活性［4-6］。但该制剂现行质量标准中仅对穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含有量进行测定［7-8］，难以全面控制其质量。

课题组前期建立了HPLC 法测定穿黄制剂中上述10 种成分的含有量，可在同一色谱条件下同时进行，而且方法简单、快速、准确。但该方法需要10 种对照品，而且有一些（如异绿原酸类、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯等）价格昂贵，从而限制了在多指标成分质量控制中的应用。

一测多评法依据中药有效成分之间存在某些内在关系的特性，只需测定某一内标即可计算其他成分的含有量［9-10］。穿黄制剂中主要含有咖啡酰奎宁酸类、二萜内酯类成分，符合一测多评法的使用原则，而且绿原酸、穿心莲内酯对照品价廉易得，故本实验分别以两者为上述2 类成分的内标，计算其他8 种成分的相对校正因子，测定其含有量，以期为该制剂质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260、Waters e2695、岛津LC-2030 Plus 高效液相色谱仪；密思博超纯水器；电子分析天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；TGL-16G 离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂 乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司，批号186356）；甲醇、乙醇等其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 对照品 新绿原酸（批号6603）、隐绿原酸（批号3208）、异绿原酸B（批号3089）对照品均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；绿原酸（批号110753-201817）、穿心莲内酯（批号 110797-200307）、脱水穿心莲内酯（批号110854-200306）对照品均购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸A（批号180307）、异绿原酸C（批号180126）对照品均购自上海融禾医药科技有限公司；新穿心莲内酯（批号20171215）、去氧穿心莲内酯（批号A2025J08）对照品均购自天津万象恒远科技有限公司。经HPLC 测定，各对照品纯度均大于98%。

1.4 药材 一枝黄花产于贵州省都匀市墨冲镇，穿心莲产于广东省湛江市，经广西中医药大学中药鉴定教研室蔡毅教授鉴定，分别为菊科植物一枝黄花Solidago decurrensLour 和爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.） Nees，均符合2015 年版《中国药典》相关规定。

1.5 制剂 穿黄清热片源自广西中医药大学制药厂（批号20171101、20161201），穿黄清热胶囊源自广西中医药大学药学中心实验室（批号20190408、20190413、20190418、20190421）、山西华元医药生物技术有限公司（批号20180101、20180701、20180704）、吉林省康福药业有限公司（批号20171106、20180303）、四川好医生药业集团有限公司（批号20180504、20180905）、江西银涛药业有限公司（批号20190201）、湖北端正药业有限公司（批号20190101）、重庆三峡云海药业有限公司（批号190301NO·043）。以上制剂的有效期均为2 年。

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 色谱条件 Agilent Technologies EC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；流动相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，10% A；10～15 min，10%～15%A；15～20 min，15%～21%A；20～30 min，21% A；30～40 min，21%～28% A；40～50 min，28%～34%A；50～65 min，34%～36%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长323 nm（0～35 min）、215 nm（35～65 min）；进样量5 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，置于10 个5 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，各取适量置于同一5 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，制成分别含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯0.184、0.258、0.202、0.260、0.178、0.093 4、0.652、1.034、0.234、1.132 mg／mL 的贮备液，精密吸取0.5 mL 于2 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（各成分含有量分别为0.046、0.064 5、0.050 5、0.065、0.044 5、0.023 4、0.163、0.258、0.058 5、0.283 mg／mL）。

2.1.3 供试品溶液制备 取穿黄清热片20 片，去掉薄膜衣；取穿黄清热胶囊10 粒，倾出内容物，均研细过5 号筛，各取约1.0 g，精密称定，置于25 mL 量瓶中，加入70%甲醇20 mL，超声（200 W、40 kHz）提取30 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，续滤液离心（13 000 r／min），上清液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.4 阴性样品溶液制备 按制剂处方和工艺，制备缺一枝黄花、缺穿心莲的阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备，即得。

2.1.5 系统适用性及专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品、阴性样品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，对照品、供试品在相应位置具有相同保留时间的色谱峰，两者UV 光谱一致；各成分色谱峰分离度均达到1.5以上，符合含有量测定要求。理论塔板数以异绿原酸C 计，均不低于41 000。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.6 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下不同质量浓度的对照品溶液各5 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，分别以S／N ＝3、S／N＝10为检测限、定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液5 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得各成分峰面积RSD 均小于1%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 精密吸取供试品溶液（批号20171101） 5 μL，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD 均小于2%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验 精密称取制剂 （批号20171101） 6 份，每份1.0 g，按“2.1.3”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下各进样5 μL 测定，测得各成分含有量RSD 均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验 精密称取含有量已知的制剂（批号20171101） 0.5 g，共6 份，精密加入含新绿原酸（0.574 mg／mL）、绿原酸（0.806 mg／mL）、隐绿原酸（0.629 mg／mL）、异绿原酸B（0.814 mg／mL）、异绿原酸 A （0.556 mg／mL）、异绿原酸 C（0.292 mg／mL）、穿心莲内酯 （0.588 mg／mL）、新穿心莲内酯（3.230 mg／mL）、去氧穿心莲内酯（0.732 mg／mL）、脱水穿心莲内酯（3.535 mg／mL）的对照品溶液1.00 mL，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下各进样5 μL 测定，计算回收率。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯平均加样回收率分别为102.8%、102.1%、100.9%、100.0%、100.3%、101.7%、98.6%、102.9%、98.6%、100.8%，RSD 分别为0.8%、1.4%、2.3%、1.3%、1.3%、2.0%、1.3%、0.55%、1.2%、1.3%。

2.2 相对校正因子测定 精密吸取“2.1.6”项下对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，以绿原酸、穿心莲内酯为内标，分别计算其他5 种咖啡酰奎宁酸、3 种二萜内酯的相对校正因子（fs／k），公式为fs／k＝fs／fk＝ （As×Ck） ／ （Ak×Cs），其中As为内标峰面积，Cs为内标含有量，Ak为待测成分峰面积，Ck为待测成分含有量，结果见表2。由此可知，各成分相对校正因子RSD 小于2%，表明其准确度良好。

表2 各成分相对校正因子（n＝6）Tab.2 Relative correction factors of various constituents （n＝6）

2.3 色谱峰定位 目前，常用的色谱峰定位方法有相对保留时间法和保留时间差法［11］。本实验先以绿原酸为内标，测定其他9 种成分在3 台色谱仪（Agilent 1260、Waters e2695、岛津LC-2030 Plus）、3 根色谱柱［Agilent Technologies EC-C18（4.6 mm×250 mm，4 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）、Waters SunFire ®C18（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）］上的相对保留时间和保留时间差，结果见表3。由此可知，采用相对保留时间法时仅新绿原酸、隐绿原酸RSD 小于5%，而采用保留时间差法时新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B RSD 仍大于5%，不符合相关要求［10］。

因此，本实验考虑同时选择绿原酸、穿心莲内酯作为内标，计算其他8 种成分的相对调整保留值，结果见表4，可知除了2 种内标外各成分RSD均小于5%，而内标可采用相对保留时间法进行定位。综上所述，相对调整保留值结合相对保留时间可实现对全部成分的准确定位。

为了考察该方法准确性，本实验取3 个质量浓度对照品溶液，在不同仪器、色谱柱下测定其保留时间预测值，并与相同条件下的实测值进行比较，结果见表5。由此可知，2 类数值接近，RSD 在0.1%～5%之间，符合相关要求［10］。

2.4 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响 以绿原酸、穿心莲内酯为内标，测定其他8 种成分在“2.2.2”项仪器、色谱柱下的相对校正因子，结果见表6，可知均无明显影响（RSD＜3%）。

表3 各成分相对保留时间、保留时间差（内标绿原酸， n＝3）Tab.3 Relative retention time and retention time differences of various constituents （with chlorogenic acid as an internal standard， n＝3）

表4 各成分相对调整保留值（n＝3）Tab.4 Relative adjusted retention values of various constituents （n＝3）

2.5 不同柱温、体积流量对相对校正因子的影响 采用Agilent 1260 高效液相色谱仪、Agilent Technologies EC-C18色谱柱，考察在柱温25、30、35 ℃，以及体积流量0.8、1.0、1.2 mL／min 下的相对校正因子，结果见表7，可知均无明显影响（RSD＜1%）。

2.6 样品含有量测定 取17 批制剂，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法测定各成分含有量，结果见表8。由此可知，2 种方法所得结果接近，RSD 均小于3%。

表5 各成分保留时间（n＝3）Tab.5 Retention time of various constituents （n＝3）

表6 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响（n＝3）Tab.6 Effects of different instruments and columns on relative correction factors （n＝3）

表7 不同柱温、体积流量对相对校正因子的影响（n＝3）Tab.7 Effects of different column temperatures and volumetric flow rates on relative correction factors （n＝3）

表8 各成分含有量测定结果（mg／g）Tab.8 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 讨论

仅以绿原酸或穿心莲内酯为内标时，不能达到其他9 种成分在不同仪器、色谱柱上相对校正因子RSD 小于3%的要求，故本实验以绿原酸为咖啡酰奎宁酸类成分的内标，穿心莲内酯为二萜内酯类成分的内标，发现2 类成分RSD 均小于3%，稳定性、重复性良好。

在待测色谱峰定位方法的选择方面，本实验比较了目前相关文献常用的相对保留时间法和保留时间差法，发现以绿原酸或穿心莲内酯为内标时，上述2 种方法均不能实现对所有成分的准确定位，再采用文献［12-13］报道的两点校正定位法，但结果仍不理想。因此，本实验同时以绿原酸、穿心莲内酯为内标，通过计算其他成分色谱峰相对调整保留值结合相对保留时间，从而实现了各成分的准确定位，其色谱峰在不同色谱条件下的预测值与实测值基本一致，RSD 均小于5%，符合一测多评法相关要求。

4 结论

本实验建立了一测多评法同时测定穿黄片、穿黄胶囊中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含有量，发现所得结果与外标法接近，RSD 均小于3%。同时，该方法操作简便，重复性、稳定性良好，结果准确可靠，可用于上述制剂的质量控制。