猪流行性腹泻病毒通过下调FBXW7 拮抗宿主抗病毒天然免疫应答的研究

2020-08-04李明蔚郭龙军石照蓉陈建飞时洪艳

中国预防兽医学报 2020年5期

李明蔚，郭龙军，石照蓉，吴洋，陈建飞，时洪艳，冯力

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨 150069）

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV），属于冠状病毒科，α冠状病毒属，是导致仔猪及断奶仔猪腹泻的重要病原之一[1-2]。病毒感染能够诱导机体产生先天性免疫应答，产生I 型干扰素（IFN-I 或IFN-α/β），在清除病毒感染及诱导机体产生被动免疫过程中发挥重要作用。I 型干扰素作为重要的细胞因子，诱导干扰素刺激基因的表达（IFN-stimulated gens，ISGs），使机体呈现抗病毒状态[3-4]。为遏制机体先天免疫应答信号的传递，阻止宿主细胞抗病毒相应分子的激活，减少或者抑制干扰素的产生，很多病毒（包括冠状病毒）已经进化形成不同的策略应对宿主细胞的先天性免疫应答反应[5-10]。FBXW7 是SCF（Skp1、Cul-1、Rbx1 和F-box蛋白复合物）型E3 泛素连接酶复合物的组成蛋白，FBXW7 能够识别并特异性结合相关底物，通过促进底物泛素化降解底物蛋白，目前FBXW7 蛋白在细胞增殖分化、肿瘤发生及转移等方面发挥重要作用。然而FBXW7 对病毒感染的调节作用鲜有报道，本研究我们发现PEDV 感染能够下调宿主细胞FBXW7 的表达，过表达FBXW7 能够抑制PEDV 复制，PEDV感染条件下FBXW7 能明显促进宿主细胞的抗病毒天然免疫反应。基于PEDV 感染能够减少FBXW7 的表达，因此PEDV 通过减少宿主细胞FBXW7 的表达从而拮抗宿主抗病毒天然免疫应答，进而利于病毒自身感染复制。本研究揭示了一种PEDV 逃逸宿主天然免疫应答的新策略，为更好阐明PEDV 的致病机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料Vero E6 和IPEC-J2 细胞由本实验室保存。RNA 提取试剂盒购自Qiagen 公司；反转录试剂盒和细胞裂解液购自海基生物科技有限公司；SYBR 荧光定量试剂盒购自Takara 公司；DMEM培养液、胎牛血清购自Gibco 公司；转染试剂购自Roche 公司； anti-mouse IgG 及anti-rabbit IgG 购自Abbkine 公司；anti-FBXW7 购自Abcam 公司；anti-HA 购自sigma 公司；鼠抗PEDV N 蛋白的抗体由本实验室自制。

1.2 病毒感染试验在显微镜下观察，待Vero E6细胞长到90%左右时，进行传代培养，根据所需浓度接种到细胞平板中，放入37 ℃温箱培养，当细胞形成单层时，用PEDV（MOI 0.1）进行接毒感染，接毒后不同时间点收集细胞样品进行western blot 鉴定。

1.3 细胞转染将适宜浓度的Vero E6 细胞接种到12 孔板中，于37 ℃，5% CO2常规过夜培养，按照转染试剂说明，将1 μg 的pCAGGS-HA-FBXW7 和pCAGGS-HA 转染Vero E6 细胞，转染后24 h 进行PEDV 感染试验（MOI 0.1），感染后24 h 和36 h 收集细胞。

1.4 细胞因子SYBR Green I 荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR）检测IPEC-J2 细胞接种到12 孔板中，37 ℃，5%CO2常规过夜培养，按照转染试剂说明将 1 μg 的 pCAGGS-HA-FBXW7 和pCAGGS-HA 分别转染IPEC-J2 细胞，转染后24 h 进行PEDV 感染（MOI 0.1），感染后24 h 收集细胞样品。常规方法提取细胞样品RNA 并进行cDNA 转录，利用TaKaRa 荧光定量试剂盒检测宿主细胞IFN-β、ISG15、ISG54 和ISG56 的转录水平。

2 结果与讨论

2.1 PEDV 感染下调FBXW7 表达Vero E6 细胞感染PEDV 后不同时间（24 h，36 h 和48 h）收集细胞样品并进行细胞裂解，通过western blot 方法检测细胞内源性FBXW7 的表达。结果显示，PEDV 感染后36 h 和48 h，PEDV 感染组的FBXW7 蛋白表达水平明显低于对照组（图1），说明PEDV 感染能够显著下调Vero E6 细胞FBXW7 的蛋白表达。本研究首次揭示PEDV 感染对FBXW7 蛋白表达的抑制作用。

图1 PEDV 感染下调FBXW7 的表达Fig.1 Reduction of FBXW7 expressions was induced by PEDV infection

2.2 FBXW7 抑制PEDV 感染复制已有研究报道，FBXW7 为SCF E3 泛素连接酶复合物的蛋白之一，FBXW7 能够特异性识别底物蛋白，通过泛素蛋白酶体途径降解靶蛋白，调节肿瘤和癌症等疾病的发生和发展[11]。为研究FBXW7 在PEDV 感染中的作用，本研究将pCAGGS-HA-FBXW7 转染Vero E6 细胞，转染24 h 后接种PEDV，在感染后24 h 和36 h 分别收集细胞样品并进行细胞裂解处理，通过western blot 方法检测重组FBXW7 的表达及其对PEDV 感染复制的作用。结果显示，重组FBXW7 蛋白正确表达；与对照组相比，过表达FBXW7 能够明显抑制PEDV N蛋白的表达水平（图2），表明重组FBXW7 能够负调控PEDV 的复制，在宿主细胞抗病毒天然免疫应答过程中发挥重要作用。

图2 过表达FBXW7 抑制PEDV 复制Fig.2 PEDV replication was inhibited by overexpressions of FBXW7

2.3 PEDV 感染条件下FBXW7 能够促进IFN-β及ISGs 因子的转录水平病毒感染可诱导宿主细胞产生干扰素及ISGs，从而使宿主细胞呈现抗病毒状态，发挥天然免疫应答反应。Vero E6 为PEDV 体外分离及传代常用的细胞系，对PEDV 易感；IPEC-J2为PEDV 体内感染的靶细胞，然而体外实验表明IPEC-J2 细胞系对PEDV 不敏感，感染效率显著低于Vero E6 细胞。此外，鉴于Vero E6 为IFN 缺陷型细胞，因此为研究FBXW7 在PEDV 感染过程中对IFN-β及ISGs 的调节作用，本研究选用IPEC-J2 细胞为感染模型。首先将FBXW7 的重组质粒转染IPEC-J2 细胞，在转染后24 h 进行PEDV 接种感染试验，接毒后24 h 收集细胞，通过荧光定量方法检测过表达FBXW7 对IPEC-J2 细胞IFN-β、ISG15、ISG54 和ISG56 转录水平的影响。结果显示，与对照组相比，FBXW7 过表达组IPEC-J2 细胞IFN-β、ISG15、ISG54 和ISG 56 转录水平显著增高（p<0.05）（图3），表明在PEDV 感染条件下FBXW7 能够促进宿主细胞IFN-β、ISG15、 ISG54 和ISG56 的转录，能够促进宿主细胞产生更好的抗病毒天然免疫应答，利于抑制PEDV 感染。

宿主先天性免疫系统形成了通过产生IFN 以及各种其他细胞因子来抑制病毒感染的第一道防线。大多数病毒感染后病毒的病原体相关分子模式被细胞的相关受体识别并进行信号转导，启动I 型IFN的快速产生，进而诱导ISGs 表达并发挥抗病毒作用，因此I 型IFN 是在病毒生命周期的任何阶段防御病毒感染的重要介体[12]。然而，病毒在进化过程中产生一系列策略拮抗宿主细胞天然免疫应答反应，如下调重要受体及节点分子的转录水平、降解信号通路中重要的节点分子、病毒感染复制产物与节点分子竞争性结合等[13]。本研究表明FBXW7 为宿主天然免疫应答正调控因子，能够抑制PEDV 感染复制，并能够促进宿主细胞IFN 及ISGs 的转录。PEDV在感染过程中能够有效抑制FBXW7 的表达，从而抑制宿主细胞天然免疫抗病毒应答反应，利于PEDV自身感染复制。本研究揭示了PEDV 拮抗宿主抗病毒应答的新策略，为PEDV 致病机制研究提供理论基础。