猪流行性腹泻病毒中和抗体PC10-IgG 重组腺病毒的构建及其抗病毒效果的研究

罗 毅，符 芳，李 亮，尹灵丹，郭珊珊，薛 美，孙 元，单玲玲，李 忍，刘 翔，冯 力，刘平黄

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道传染病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）可引发猪的腹泻、脱水、呕吐，对7日龄的仔猪致死率接近100%，给养猪业带来了严重的危害[1]。我国在2010 年出现PEDV 变异株后，引起了PED 大规模暴发，并迅速流行。尽管市场上有PEDV 的灭活苗和弱毒苗，但大部分疫苗都是用于接种母猪，以提高其血清与乳汁中的抗体水平，进而对仔猪产生被动免疫保护作用，但由于疫苗广谱性不够且保护效果与母猪泌乳量密切关联，有时免疫保护效果并不理想，时常有PED疫情的暴发[2]。因此，开发研究针对该病的新的治疗性制剂很有必要。有研究表明，变异株主要在PEDV 的S 基因区产生突变[3]。而本实验室之前通过B 细胞PCR 技术分离到一株PEDV 广谱中和抗体PC10-IgG，其被证明可靶向结合PEDV S 蛋白的构象表位，能特异性的结合基因Ⅰ型和Ⅱ型PEDV，并有效抑制两种基因型的PEDV 感染，因此其具有开发成治疗性抗体的潜能[4]。

腺病毒是目前应用较为广泛的基因治疗载体之一，它是一种非整合性双链DNA 病毒，在自然界中广泛分布。腺病毒作为载体具有易于制备、纯化和浓缩；获得的病毒滴度高；能稳定表达外源基因，却不能将其整合到宿主基因等优点[5]。而人5 型复制性缺陷型腺病毒（Ad5）就是其中发展较为成熟的一种腺病毒载体用于人或动物疫苗的研制[6]；此外，该载体还被用于表达干扰素，后者在动物体内呈现良好的抗病毒效果[7]。有研究表明Ad5 能够感染猪的小肠并表达目的蛋白，表达的目的蛋白在感染后的48 h～72 h 出现高峰期[8]。基于此，本研究通过构建表达PC10-IgG 的重组腺病毒Ad5-PC10-IgG，对其在体外和小鼠体内的表达水平和抗病毒效果进行初步探究，以期为防治PED 提供一种新型的潜在治疗制剂。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料HEK293 细胞、Vero E6 细胞、PEDV CV777 株、猪小肠类器官肠小体、PEDV 高免猪血清241、鼠源抗PEDV N 蛋白单克隆抗体（MAb）[9]由本实验室保存；Lipofectmine 3000 购自Invitrogen 公司；DMEM、DMEM/F12 培养基和胎牛血清均购自GIBCO 公 司；Kpn I、Xho I、Pme I、Pac I 内 切 酶 以及T4 连接酶均购自NEB 公司；大肠杆菌BJ5183 感受态细胞购自Genmed 公司；大肠杆菌XL10-GOLD感受态细胞购自唯地生物科技有限公司；树脂Protein A 购自美国Abbkin 公司；鼠抗猪IgG-FITC 购自Bioscience 公司；羊抗猪IgG-HRP 和羊抗猪IgG H&L-FITC 均购自Abcom 公司；羊抗猪IgG（FC）抗体购自Bio-RAD 公司；羊抗鼠-FITC 抗体购自Thermo公司；DyLight 700 抗羊抗体购自北京中杉金桥生物公司；DAPI 购自Sigma 公司；SYBRTMGreen 荧光定量试剂盒购自Invitrogen 公司；TMB 购自Amiresco 公司；Pshuttle-CMV 质粒以及AdEasyTM质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所孙元老师惠赠。

1.2 重组腺病毒质粒pad5-PC10-IgG 的构建与鉴定在PC10-IgG全长基因序列中插入furin蛋白酶切割位点和2A 元件[10]，并在PC10-IgG 5'端设计Kpn I 酶 切位点，在3'端设计Xho I 酶切位点后，由北京六合华大基因科技有限公司制成穿刺菌菌种，涂板，提取质粒。利用Kpn I/Xho I 双酶切该质粒获得的PC10-IgG 基因片段克隆到pshuttle-CMV 穿梭载体中，构建重组穿梭载体pshuttlePC10-IgG。Kpn I 和Xho I 双酶切并测序鉴定正确后将pshuttlePC10-IgG 质粒电转化至Ad5 骨架质粒AdEasyTM 中经同源重组构建重组腺病毒质粒pad5-PC10-IgG 并通过Pac I 单酶切鉴定。按同样的方法将pshuttle-CMV 与Ad5 骨架质粒同源重组构建腺病毒空载体pAd5。

1.3 重组腺病毒Ad5-PC10-IgG 的构建与鉴定待6 孔板中的HEK293 细胞培养至80%～90%密度时进行下述的质粒转染：将4 μg pad5-PC10-IgG 与pAd5利用Pac I 酶切，将二者分别与LIP3000 试剂混合后转染HEK293 细胞。转染8 h 后将培养液换成含有3%FBS 的培养液。于37 ℃5%CO2培养10 d～12 d直至出现细胞病变（CPE）后，反复冻融离心收获上清，以该培养上清为一抗，羊抗猪IgG-HRP（1:80 000）为二抗，采用间接ELISA 方法检测，结果为阳性的即为重组腺病毒Ad5-PC10-IgG，将其接种HEK293 细胞，待出现CPE 后继续传至第4代，采用壳蛋白免疫法测定该重组病毒的效价为108pfu/mL[11]。将Ad5-PC10-IgG 按MOI 5 的剂量接种密度为2×107个/mL 的HEK293 悬浮细胞，显微镜观察细胞发生50%的CPE后收获细胞及上清。离心后按上述方法测定Ad5-PC10-IgG 的效价为1×1011pfu/mL，用于后续小鼠试验。

1.4 Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 细胞后PC10-IgG 表达的鉴定将1.3 获 得 的Ad5-PC10-IgG 以MOI 5感染HEK293细胞，48 h收获上清经树脂protein A 纯化后，采用SDS-PAGE 鉴定上清中的PC10-IgG，同时将241血清经树脂protein A纯化获得的IgG和Ad5感染的293细胞上清分别作为阳性、阴性对照。以羊抗猪IgG（FC）（1:5 000）为一抗，DyLight 700 抗羊抗体（1:10 000）为二抗，通过western blot 进一步鉴定。

1.5 PC10-IgG 表达量的测定将Ad5-PC10-IgG 以MOI 2 感染HEK293 细胞，分别收获感染后48 h、60 h、72 h、84 h、96 h 和108 h 细胞培养上清，以该培养上清为一抗，羊抗猪IgG-HRP（1:80 000）为二抗，采用间接ELISA 方法检测细胞培养上清中PC10-IgG 的表达量。同时将241 血清和Ad5 感染293细胞的上清分别作为阳性、阴性对照。

1.6 PC10-IgG 对PEDV 结合活性的检测将PEDV 病毒液稀释至4 000 TCID50后接种96 孔板中处于对数生长期的Vero E6 细胞，37 ℃孵育2 h 后，加入3%FBS 的DMEM 继续培养。感染36 h 后用多聚甲醛固定细胞，Triton X-100 打孔后用含5%的脱脂乳和5%胎牛血清的PBS 封闭2 h 后，以Ad5-PC10-IgG感染的HEK293 细胞上清为一抗，羊抗猪IgG H&L-FITC（1:800）为二抗， DAPI（1:100）染细胞核，同时设241 血清为阳性对照，Ad5 感染的HEK293 细胞上清、正常Vero E6 细胞为阴性对照以及加相同体积封闭液的PEDV 对照。经IFA 检测PC10-IgG 对PEDV 结 合 活 性。

1.7 PC10-IgG对PEDV抑制活性的检测取100 μL感染Ad5-PC10-IgG的HEK293细胞培养上清与100 μL PEDV CV777 株（4 000 TCID50/mL，含3 μL/mL 0.25%胰酶，1%sp）混合，37 ℃孵育1 h 后加入到96 孔板中生长良好的Vero E6 细胞中，37 ℃孵育2 h 后，加入3%FBS 的DMEM 继续培养。36 h 后，分别收取细胞培养上清和细胞。提取培养上清中的RNA 并反转录cDNA 后作为模板，以F：5'-GCACTTATTGGCAG⁃GCTTTGTR-3'/R：5-CCATTGAGAAAAGAAAGTGTCG⁃TAG-3'为引物，利用SYBRTMGreen I 荧光定量PCR 检测PEDV 的载量；同时以鼠源抗PEDV N 蛋白MAb（1:100）为一抗，羊抗鼠FITC-IgG（1:500）为二抗，DAPI（1:100）染 细 胞 核， IFA 检 测PC10-IgG 对PEDV 的抑制活性，同时设241 血清为阳性对照，Ad5 感染的HEK293 细胞上清、正常Vero E6 细胞为阴性对照以及PEDV 对照。

1.8 Ad5-PC10-IgG 感染猪小肠类器官模型肠小体试验将回肠小体[12]在96 孔板培养至90%左右，以MOI 10 的剂量接种重组腺病毒Ad5-PC10-IgG，同时设Ad5 感染的回肠小体以及正常的回肠小体为对照。37 ℃孵育36 h 后收获细胞上清采用ELISA 检测PC10-IgG 的表达（方法同1.5）；同时加入羊抗猪IgG H&L-FITC（1:800）抗体，采用直接免疫荧光试验检测肠小体中PC10-IgG 的表达。

1.9 Ad5-PC10-IgG 接种小鼠试验将12 只BALB/c小鼠随机分成3 组，每组4 只，其中两组分别肌肉注射0.5 mL 1.3 中效价为1×1011pfu/mL 的Ad5-PC10-IgG 和Ad5，一组肌肉注射0.5 mL DMEM 为阴性对照。在接种后不同时间（0、1 d、3 d、5 d、7 d）采集各组小鼠血分离血清和采集肛拭子，两种样品经PBS 5倍稀释后利用1.5 的ELISA 检测PC10-IgG 的含量；利用1.6、1.7的步骤与方法（将小鼠血清代替Ad5-PC10-IgG 接种的细胞上清）分别检测接种后0、3 d 与7 d 小鼠血清中PC10-IgG 对PEDV 的结合活性与抑制病毒复制效果。

1.10 数据统计采用Graphpad prism 7.0 进行数据分析。采用t 检验分析数据的显著性差异。*：p<0.05（差异显著）、**：p<0.01（差异非常显著）、***：p<0.001、****：p<0.0001（差异极显著）、p>0.05 无统计学意义（ns）。

2 结 果

2.1 重组腺病毒质粒pad5-PC10-IgG 的鉴定结果将构建的穿梭质粒pshuttlePC10-IgG 经双酶切鉴定结果显示，获得的目的片段大小为2.4 kb 左右，测序结果显示片段序列与设计的序列一致。将pshut⁃tlePC10-IgG 质粒与腺病毒骨架质粒AdEasyTM 进行同源重组，构建重组腺病毒质粒pad5-PC10-IgG。经单酶切鉴定结果显示片段大小为23 kb左右，且4.5 kb处有均一条带，与预期一致，表明重组腺病毒质粒正确构建。 将重组腺病毒质粒转染HEK293 细胞10 d后出现CPE，收获的细胞培养上清经间接ELISA检测结果表明重组腺病毒Ad5-PC10-IgG 正确构建。但仍需后续鉴定重组腺病毒能否表达PC10-IgG。

2.2 Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 细胞后PC10-IgG 表达的鉴定结果将重组腺病毒感染HEK293 细胞后的培养上清纯化后，经SDS-PAGE 鉴定。结果显示，纯化的PC10-IgG 有两条目的条带，大小与纯化的猪阳性血清中IgG 的重链与轻链大小一致，分别为55 ku 和25 ku 左右。Ad5 感染的细胞上清中无该目的条带（图1A）。western blot 鉴定结果显示，纯化的PC10-IgG 出现大小约55 ku 的特异性条带，与阳性对照一致，而阴性对照无条带（图1B）。进一步表明重组腺病毒Ad5-PC10-IgG 正确构建，且其感染HEK293 细胞后能够分泌表达PC10-IgG。收获重组腺病毒Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 细胞后不同时间的细胞上清经ELISA 的检测，结果显示，Ad5-PC10-IgG 感染细胞后在上清中能够分泌表达PC10-IgG，感染后48 h 分泌表达的PC10-IgG 能达到10 μg/mL，并且在72 h 表达量最高，为39 μg/mL，直至108 h，PC10-IgG 的表达量还能达到35 μg/mL 左右（图1C）。表明构建的重组腺病毒Ad5-PC10-IgG 感染HEK293细胞后能够分泌表达高水平的PC10-IgG，并且上清中的PC10-IgG 表达量在35 μg/mL 左右能够维持36 h之久。

图1 Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 细胞上清中分泌表达的PC10-IgG 的SDS-PAGE（A）、western blot（B）及ELISA（C）的检测结果Fig.1 Results of SDS-PAGE(A),westen blot(B)and ELISA(C) of PC10-IgG secreted and expressed in the supernatant of Ad5-PC10-IgG infected HEK293 cells

2.3 PC10-IgG 对PEDV 的结合试验检测结果将PEDV 感染Vero E6 细胞，36 h 后经IFA 检测Ad5-PC10-IgG 感染的HEK293 细胞培养上清中PC10-IgG的病毒结合活性。结果显示，该细胞培养上清中的PC10-IgG 和241 阳性对照血清均能与感染Vero E6 细胞的PEDV 特异性结合，呈现特异的绿色荧光，而Ad5 感染的细胞上清+PEDV，PEDV 对照和未感染PEDV 的细胞对照均未出现特异的绿色荧光（图2）。表明Ad5-PC10-IgG 表达的PC10-IgG 能够特异性结合PEDV。

图2 Ad5-PC10-IgG 分泌表达的PC10-IgG 对PEDV 结合活性的检测结果Fig.2 Results of the binding activity of the secreted PC10-IgG to PEDV

2.4 PC10-IgG 的病毒抑制试验结果将PEDV CV777 株与Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 的细胞培养上清共孵育，再感染Vero E6 细胞。36 h 后经IFA 和荧光定量PCR 分别检测Ad5-PC10-IgG 分泌表达的PC10-IgG 的病毒抑制活性。结果显示，与Ad5 感染的HEK293 的细胞上清+PEDV 组和PEDV 对照组感染的Vero E6 细胞相比，PC10-IgG+PEDV 感染的Vero E6 细胞特异性的红色荧光显著减少（图3A），表明Ad5-PC10-IgG 分泌表达的的PC10-IgG 几乎完全抑制了PEDV 的感染。荧光定量PCR 结果显示，Ad5-PC10-IgG 分泌表达的PC10-IgG+PEDV 共感染的Vero E6 细胞上清中的病毒载量（446.7 拷贝/100 μL）与正常Vero E6 细胞上清（497 拷贝/100 μL）、241 阳性血清对照+PEDV 共感染的Vero E6 细胞上清（498 拷贝/100 μL）基本一致均呈阴性结果；而其与Ad5 感染的HEK293的细胞上清+PEDV共感染的Vero E6细胞上清（32 509拷贝/100 μL）和PEDV感染的Vero E6细胞上清（16 939 拷贝/100 μL）差异极显著（p<0.01）（图3B），经计算该组病毒载量比PEDV 对照降低了97.3%左右，该结果与IFA 结果一致。以上结果表明Ad5-PC10-IgG 感染HEK293 细胞分泌表达的PC10-IgG 能够有效抑制PEDV 感染Vero E6 细胞。

2.5 Ad5-PC10-IgG 感染猪小肠类器官模型肠小体的检测结果将Ad5-PC10-IgG 接种猪的小肠类器官模型回肠小体，36 h 后收获上清进行间接ELISA 检测，并对回肠小体进行IFA 检测。ELISA 结果显示Ad5-PC10-IgG 感染肠小体后能够在其上清中检测到PC10-IgG 的表达（图4A）；直接免疫荧光结果显示，Ad5-PC10-IgG 感染的肠小体出现特异性绿色荧光，而Ad5 感染的肠小体与正常的肠小体则没有荧光（图4B）。表明重组腺病毒Ad5-PC10-IgG可以感染猪的小肠类器官模型肠小体，并且分泌表达PC10-IgG。

2.6 Ad5-PC10-IgG 感染小鼠的试验结果收集小鼠接种Ad5-PC10-IgG 后不同时间的血清和肛拭子经间接ELISA 检测。结果显示，虽然接种Ad5-PC10-IgG 小鼠的肛拭子中没有检测到PC10-IgG，但在接种后第1 d（1dpi）的小鼠血清中检测到PC10-IgG 的含量为2.78±0.5 μg/mL，第3 d（3 dpi）为2.72±0.12 μg/mL，直至第5 d（5dpi）还能检测到0.7±0.84 μg/mL 的PC10-IgG，在接种后0 和7 d（7dpi）没有检测到PC10-IgG的表达；而Ad5 接种的小鼠血清和阴性对照组没有检测到PC10-IgG（图5A），表明Ad5-PC10-IgG 在小鼠体内也能表达分泌PC10-IgG。

选择Ad5-PC10-IgG 接种0、3 dpi、7 dpi 的小鼠血清，5 倍稀释后进行了PEDV 的结合试验和病毒抑制试验。结果显示，接种Ad5-PC10-IgG 3 dpi 的小鼠血清能与感染Vero E6 细胞的PEDV 特异性结合，呈现特异的绿色荧光，而接种Ad5-PC10-IgG 0、7 dpi 的小鼠血清+PEDV 以及其它对照组的细胞均未出现特异的绿色荧光（图5B）。在病毒抑制试验中接种Ad5-PC10-IgG 3 dpi 的小鼠血清+PEDV、未感染PEDV 的细胞对照基本无特异性红色荧光，而Ad5-PC10-IgG 0、7 dpi 和其余对照组的细胞均有大量红色荧光（图5C）。荧光定量PCR 结果显示接种Ad5-PC10-IgG 3 dpi 的小鼠血清+PEDV 感染的Vero E6 细胞上清以及正常Vero E6 细胞上清中的病毒载量分别为294 拷贝/100 μL、725 拷贝/100 μL，远低于其余各组的病毒载量（≥104拷贝/100 μL）（图5D）（p<0.05；p<0.01）。因此这两个试验再次印证了上述ELISA 对小鼠血清的检测结果，同时也表明Ad5-PC10-IgG 在小鼠体内表达的PC10-IgG 对PEDV具有很好的结合活性与抑制病毒复制的效果。

图5 小鼠血清中PC10-IgG 的表达（A：ELISA）、其对PEDV 结合活性（B：IFA）及病毒抑制活性（C：IFA 和D：RT-qPCR）的检测结果Fig.5 Results of the expression of PC10-IgG in mice serum(A,ELISA);mice serum PC10-IgG-binding activity(B,IFA);mice serum PC10-IgG viral inhibitory activity(C,IFA and D,RT-qPCR)

3 讨 论

PEDV 对各个年龄段的猪均能致病，尤其对仔猪的致死率接近100%，给养猪行业带来了重大的经济损失。虽然市场上有针对于PEDV 的疫苗，但能直接用于仔猪的PEDV 疫苗和治疗制剂目前尚在研究中[13]。本研究利用Ad5 为载体来构建表达PEDV中和抗体PC10-IgG 的重组腺病毒Ad5-PC10-IgG。实验结果显示构建的Ad5-PC10-IgG 在感染HEK293细胞后，分泌的PC10-IgG 不仅重链和轻链与猪源IgG 一致，western blot 结果也显示PC10-IgG 的重链也能被抗猪IgG FC 片段抗体所识别，表明重组腺病毒Ad5-PC10-IgG 在感染HEK293 细胞后能够表达PC10-IgG，且PC10-IgG 为完整的猪源IgG。

Ad5-PC10-IgG 感染HEK293细胞的培养上清中表达的PC10-IgG分泌量约能达到39.975 μg/mL，并且含量在30 μg/mL 以上能维持36 h 之久，而在接种Ad5-PC10-IgG的小鼠体内PC10-IgG的表达量最高也能达到约13.6 μg/mL，而在接种后第5 d 其表达量还能达到3.5 μg/mL。并 且 表 达 的PC10-IgG 对PEDV 具有很好的结合活性与抑制病毒复制的效果。本实验室前期研究结果显示PC10-IgG 对CV777 株（G1）的病毒感染半数抑制量（IC50）为0.103 μg/mL，对Lnct 2 株（G2）的IC50为5.23 μg/mL[4]，而本研究构建的Ad5-PC10-IgG表达的PC10-IgG 量远高于上述结果，表明Ad5-PC10-IgG 分泌的该抗体含量足够达到相应的抗病毒效果。有研究表明Ad5 能够感染猪的小肠并表达目的蛋白[6]，本实验结果也表明Ad5-PC10-IgG 感染猪的小肠类器官模型也可以分泌表达PC10-IgG。而猪的小肠为PEDV 靶器官，推测Ad5-PC10-IgG 具有在猪的小肠上皮细胞抑制PEDV 感染的潜能。

在小鼠实验中，接种Ad5-PC10-IgG 的小鼠虽然在其肛拭子中没有检测到PC10-IgG，但在其血清中检测到了该抗体：接种后第1 d 的小鼠血清中就出现了较高含量的PC10-IgG（13.6±0.14 μg/mL），而在接种后第5 d 还能达到3.5 μg/mL。推测可能是由于采集的拭子体积太小样本量没有达到检测的临界值。本实验用的是6 周龄小鼠，免疫系统已完善，PC10-IgG 在小鼠体内为外源蛋白，所以无论是载体还是PC10-IgG 都会被小鼠免疫系统迅速清除，在这种条件下重组腺病毒Ad5-PC10-IgG 接种小鼠后第5 d 还能在其血清中检测到PC10-IgG。表明小鼠试验中Ad5-PC10-IgG 的接种剂量完全达到要求。之前相关研究都是利用Ad5 在机体内表达抗原以引起机体的免疫应答。利用Ad5 在小鼠和猪体内表达抗体之前未有相关报道。因此，本研究利用重组腺病毒Ad5-PC10-IgG 在小鼠体内表达PC10-IgG 的接种剂量及该实验本身不仅为Ad5-PC10-IgG 感染猪的实验提供借鉴，而且对相关研究也具有参考价值。

本实验构建的Ad5-PC10-IgG 可以在小鼠体内和体外表达具有生物活性的PC10-IgG，表明其具备成为PEDV 治疗制剂的潜力，但是PEDV 存在诸多亚型，且亚型与亚型之间存在遗传差异，表达的PC10-IgG 对PEDV 变异株的抑制效果还有待进一步研究[14]。另外对仔猪的接种剂量以及保护效果也值得进一步探究。