凝固酶阴性葡萄球菌研究进展

张 行，杨 峰，严 勇，李新圃，王旭荣，罗金印，李宏胜

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业农村部兽用药物创制重点实验室/甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃 兰州730050）

葡萄球菌分为凝固酶阳性（Coagulase-positive staphylococci，CPS）和凝固酶阴性（Coagulase-negative staphylococci，CNS）两大类，到目前为止，葡萄球菌属包括49 种、26 个亚种葡萄球菌[1-2]。长期以来，人们对葡萄球菌致病性的研究主要集中在CPS 上，而对CNS 的关注和研究较少。然而，随着CNS 在临床中检出率的不断升高，人们开始重视这一类病原菌的深入研究。

CNS 是一种人畜共患条件致病菌之一，能引起人和动物的多种感染[3]。对人类的致病性主要引起心内膜炎、败血症和血液感染等疾病；对动物的致病性主要引起奶牛的乳腺炎，尤其在牛隐性乳房炎中，CNS 已成为包括我国在内的国家或地区奶牛乳房炎的主要病原菌[4-6]。人或动物一旦感染CNS，将会很难彻底治愈，因为CNS 通常会在物体或组织表面产生生物被膜（Biofilm，BF），进而对多种抗生素表现耐药[7]。BF 的产生可使CNS 对抗生素的耐药性增加1 000 倍[8]。此外，CNS 还能产生各种致病因子，如脂肪酶，脱氧核糖核酸酶和肠毒素等，对人和动物造成损害[9]。为了更好的治疗和控制CNS 相关疾病，本文从CNS 常见的检测鉴定方法、致病性、致病因子、耐药性及耐药机制等方面进行综述，以期为更好的防范和治疗CNS 相关疾病提供理论依据。

1 CNS 检测鉴定技术研究

CNS 属于革兰氏阳性球菌，不产生血浆凝固酶，但可产生耐热核酸酶，在血琼脂平板上出现α、β或δ溶血。根据检测原理的不同，CNS 的鉴定方法主要有表型鉴定和基因型鉴定两类。表型鉴定方法，即传统微生物培养生化鉴定法主要包括API葡萄球菌检测试纸条和BD 自动化微生物鉴定系统。基因型鉴定方法主要有扩增片段长度多态性指纹图谱（AFLP）、16S rRNA 基因测序、PCR 法和全基因组DNA 杂交分析等。此外，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法（MALDI-TOF MS）也可用于CNS 不同种属的鉴定分析。但由于各种条件的限制，目前最常用的CNS 检测鉴定方法有传统微生物培养生化鉴定法、16S rRNA 基因测序比对法和PCR法等。

1.1 传统微生物培养生化鉴定法

在葡萄球菌属的生化鉴定方法中，最常见的是法国梅里埃公司旗下的API 细菌鉴定系统，该系统根据某种细菌的特征生化反应，能够对细菌进行种或属水平的鉴定。根据API 软件的操作说明，认为当鉴定结果的置信度大于80%的时候，鉴定结果准确。然而，常规生化表型鉴定方法是葡萄球菌鉴定的初级方法，其鉴定结果的准确性有限，这主要是由于同种菌株间存在表型差异或突变。通常，传统微生物培养生化鉴定法的准确度较低，仅为50.0%～70.0%[10]。

1.2 16S rRNA 基因测序比对法

细菌的rRNA 是细菌细胞内含量最多的RNA，包括5S、16S 和23S rRNA。其中16S rRNA 遗传信息量适中，具有遗传稳定性，保守性高，结构和功能具有高度保守性，被称为细菌的“活化石”，是研究细菌系统进化和种属鉴定的重要材料。郝俊玺等通过16S rRNA 基因测序比对，对60 份疑似CNS 菌株的样品均鉴定到了种水平，鉴定准确率达100.0%[11]。Kim 等通过16S rRNA 测序技术，对55 份葡萄球菌菌株进行种属水平的鉴定，也全部鉴定成功，并且所有受试菌株16S rRNA 检测的同源性均在98.0%～100.0%[12]。该方法较传统微生物培养生化鉴定法的敏感性与准确性均有所提高，但耗时长，对于亲缘性关系相近的菌种辨别能力差。

1.3 PCR 法

通过对细菌的一种或多种高度保守的管家基因测序，可实现准确鉴定病原菌的目的。在CNS 检测鉴定方面，常用的目的基因有hsp60、gap、sodA、tuf 和rpoB 等[13]。Kim 等 通 过 设 计7 对 特 异 性sodA 基因引物，对CNS 进行了种水平的鉴定，共鉴定出7种CNS 亚种[12]。Drancourt 等通过设计一对rpoB 基因通用引物，对29 株葡萄球菌进行鉴定，均能准确鉴定到不同的CNS 亚种水平，且不同菌株间rpoB 扩增序列相似性为71.6%～93.6%，相比16S rRNA 鉴定方法，结果更准确[14]。基于管家基因的PCR 方法的可靠性与16S rRNA 测序方法相同，但前者操作简单，耗时短，并且葡萄球菌管家基因的分化程度往往高于16S rRNA，鉴定结果更准确。

2 CNS 的致病性研究

奶牛乳房炎是指奶牛乳腺组织受到病原微生物的侵袭而导致的乳腺组织炎症，通常由葡萄球菌，链球菌和大肠杆菌等细菌引起[15]。根据临床症状的不同，可将奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和隐性乳房炎，前者通常以肉眼可见的临床症状为主，如乳房红肿、硬结、血乳、乳汁水样变性等，后者无明显临床表征，但乳汁体细胞数明显升高，牛乳质量和奶产量显著降低。近些年来，CNS 已经成为奶牛乳房炎频繁暴发和流行的主要诱因，尤其对于奶牛隐性乳房炎而言，CNS 更是其最主要的病原菌，并导致乳腺持续性感染[5,16]。Piessens 等对134 份牛乳样品的研究发现，产色葡萄球菌的分离率最高（30.6%），其次是溶血葡萄球菌（27.6%）和表皮葡萄球菌（11.9%）[17]。De Visscher 等研究表明，在300 份灌装奶样中，CNS 的检出率达90.0%，其中马胃葡萄球菌是CNS 的优势菌种，分离率占24.1%，其次是溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌，检出率分别为12.9%和7.5%[16]。

3 CNS 的致病因子研究

3.1 BF

BF 是细菌产生的可以把细菌细胞包裹起来的网状聚合基质，主要成分是胞间粘附多糖（Polysaccha⁃ride of intercellular adhesion，PIA），此外还有BF 相关蛋白组分[18]。细菌首先吸附在物体表面，然后经聚集、成熟和剥离形成三维结构的聚合物，BF 的产生大大增强了CNS 对外界不良环境的抵抗力，对其在牛群之间的传播和持续性感染至关重要[19-20]。BF 是CNS 最重要的毒力因子之一，由细胞间粘附基因座icaADBC 编码合成，能阻碍吞噬细胞的吞噬，保护细菌逃避宿主免疫系统的识别和杀灭作用，此外还可阻碍抗菌药物渗透进入菌体[21-22]。Martins 等研究发现，在112 株CNS 菌株中，61.6%的CNS 能够产生BF，操纵子icaADBC 的检出率为8.9%[18]。Shrestha 等通过试管粘附法、刚果红试验法和组织培养板法3 种方法检测CNS 的BF 形成能力，结果显示，71 株CNS 的BF 形成能力分别为82.0%、78.0%和71.8%[23]。BF 的形成是细菌的一种自我保护的毒力机制[24]。

3.2 肠毒素

葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SE）是由葡萄球菌合成并分泌到细胞外的一类毒素物质。SE 对热有较高的耐受性，烹饪通常不能使其失活，即使巴氏消毒过程可以杀灭该病原菌，但其肠毒素的生理活性仍然存在，是引起食源性中毒的主要原因[25-26]。不同类型的肠毒素对热耐受能力不同，但在100 ℃加热30 min 条件下均不能完全破坏其活性，具体表现为B 型耐热能力最强，C 型次之，A 型最差。通常，较常见的5 个经典肠毒素有SEA、SEB、SEC、SED 和SEE，但近些年来，一些新的SE 种类相继出现，包括SEG、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN 和SEQ 以及SER 等。de Frei⁃tas 等研究发现，在128 株CNS 菌株中，有66.0%的菌株携带肠毒素基因，肠毒素基因sea、seb和sec的携带率较高，其中sea 在CNS 中检出率最高（35.1%）[27]。Piechota 等研究报道，经典肠毒素基因在CNS 中的流行率为13.7%，部分CNS 同时携带2 种或者3 种肠毒素基因，其中sec 的检出率高达70.0%[28]。

3.3 中毒休克综合征毒素

中毒休克综合征毒素（Toxic shock syndrome tox⁃in-1，TSST-1）是葡萄球菌相关超抗原毒力因子家族的主要成员之一，由tsst-1 基因编码，是一种中毒性休克毒素，能使毛细血管的通透性增加，进而造成心血管功能紊乱，导致机体局部甚至全身的中毒休克综合征。Mahato 等对印度不同地区分离获得的62 株CNS 的研究发现，仅2 株溶血性葡萄球菌中携带有tsst-1 基因，检出率为3.2%[3]，与da Cunha 等人报道的tsst-1 检出率为4.2%（5/120）基本一致[20]。但另有研究显示，在分离自奶牛乳房炎的102 株CNS 中，并未检测到TSST-1 超抗原编码基因[29]，所以目前人们猜测TSST-1 可能通过某种机制调节CNS的致病性，而不是其关键的毒力因子。

3.4 脂肪酶

CNS 通常能产生3 种常见的脂肪酶，分别是GehC、GehD 和Geh-1，这3 种脂肪酶彼此之间序列高度相似，由4 个开放阅读框编码[9]。GehC、GehD和Geh-1 均以酶原前体的形式被分泌到细胞外，4个开放阅读框的脂肪酶编码基因也具有一定的相似性，可能在于不同的底物特异性，信号肽区和成熟脂肪酶区在各类脂肪酶蛋白中高度保守。通常认为，前肽区对于成熟脂肪酶的正确折叠具有重要指导作用，不同脂肪酶之间其相似性较小，保守序列“SIRK”则起到高效输出脂肪酶的作用。另外，鉴于脂肪酶GehC 和Geh-1 彼此的高度相似性（包括序列相似和功能相似），有人推测两者可能不是受不同基因编码，而是菌株突变的结果。脂肪酶可使细菌长期定植于人或哺乳动物皮肤的脂质分泌物中，并通过阻碍吞噬细胞的吞噬作用而发挥毒力作用。研究发现，脂肪酶GehD 可以与胶原蛋白结合，这一发现可能为脂肪酶的致病性研究开辟了一条新的途径[30]。

3.5 杀白细胞素

杀白细胞素（Panton-Valentine leucocidin，PVL）是由LukS-PV 和LukF-PV 组成的双组分成孔细胞毒素蛋白，经胞内合成并分泌到细胞外，然后组装成穿孔七聚体，对嗜中粒细胞膜具有裂解效应[31]。Mahato 等研究发现，pvl 基因在62 株CNS 中的检出率为6.5%，其中松鼠葡萄球菌的携带率最高，占50.0%[3]。不同地区CNS 的pvl 携带率差异较大，孙垚等研究发现，在广东部分地区分离的40 株奶牛乳房炎性CNS 中，并未检测到pvl 基因[32]。

此外，层粘连蛋白，白细胞毒素，细胞毒性金属蛋白酶，FA-修饰酶和耐热核酸酶等也是CNS 常见的致病因子，当机体受到病原菌侵袭时，这些因子往往协同作用于机体，造成动物感染发病。

4 CNS 的耐药性与耐药机制研究

近年来，由于临床上抗生素的滥用造成的细菌耐药现象引起了世界各国的高度关注，多重耐药现象也越来越普遍。当今，葡萄球菌抗生素耐药性问题日益严重，是全球公共卫生体系面临的一个严峻挑战，深入开展葡萄球菌致病性和耐药性研究，并科学、准确的检测病原菌的耐药谱对规范临床合理用药，减少耐药菌株的产生有着重要的指导意义。

4.1 耐药性研究

在人源CNS 耐药性研究方面，Fowoyo 等对尼日利亚不同地区CNS 的调查研究表明，CNS 对氨苄西林的耐药性最为严重，耐药率达到86.7%，其次是磺胺甲噁唑-甲氧苄啶和阿莫西林克拉维酸钾，耐药率分别为74.9%和52.5%[33]；其中以表皮葡萄球菌对氨苄西林耐药最严重，占92.0%，山羊葡萄球菌对氨苄西林耐药率最低，为69.0%。同样，Nanou⁃kon 等研究发现，在非洲西部地区，CNS 对临床上常用的几类抗生素也表现出较高的耐药性，具体表现为对青霉素普遍耐药，耐药率为92.0%，对苯唑西林，头孢西丁和磺胺甲噁唑-甲氧苄啶呈高度耐药，耐药率分别为74.0%、74.0%和72.0%，而所有CNS 菌株对呋喃妥因和利福平敏感，敏感性均在94.0%以上[34]。在牛源性CNS 耐药性研究方面，Xu等对江苏某奶牛场2012 年～2014 年间的流行病学调查研究发现，该地区CNS 菌株对青霉素产生了严重耐药，耐药率达86.8%，对红霉素，链霉素和四环素表现出中等强度的耐药，耐药率分别为48.7%、46.1%和39.5%，大多数CNS 菌株对庆大霉素和妥布霉素敏感，敏感性均在86.8%以上，此外对两种以上抗生素耐药的多重耐药菌株占79.4%[35]。Breser 等研究结果表明，牛源CNS对青霉素的耐药率最高，为85.0%，对红霉素和氨苄西林的耐药率也达到71.0%和57.0%，而对利福平敏感，敏感性为86.0%[36]。同时，董志民等报道指出，东北地区奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌对青霉素耐药严重，耐药率达70.0%[37]。

综合看来，人源和牛源CNS 在耐药谱上呈现出一定的相似性，表现为人源株和牛源株CNS 均对青霉素和氨苄西林产生了较高程度的耐药，而对利福平敏感。

4.2 耐药机制研究

在细菌耐药性与抗菌药物研发速度的竞争中，细菌往往具有更容易产生耐药性的优势，并且细菌耐药性遗传决定因子可在不同种属的病原菌间传播，进而获得表型耐药，对大多数抗生素产生耐药性[38-40]。CNS 对抗生素产生耐药性通常由以下4 种途径：改变药物的靶向位点、酶的失活、降低细胞膜的通透性和外排泵介导的药物外排[41]。细菌耐药性机制为研究人员进行科学研究提供了良好的细胞靶点来设计和开发新型抗菌药物，细菌常见的耐药机制如图1 所示。

图1 CNS 耐药机制Fig.1 Resistance mechanism of CNS

5 小结与展望

在长期的进化过程中，CNS 已经形成了一套符合自身生存的各种耐药因子与致病因子协调作用的宿主适应机制。对CNS 进行快速而准确的鉴定可以阻断致病性CNS 的传播，并有助于减少耐药菌株的产生。分子鉴定技术能够对临床上CNS 相关感染性疾病做出准确的鉴别，分析是哪一种CNS 导致的机体患病，从而更加高效的制定治疗方案。然而，CNS 种类繁多，每种CNS 亚种携带的毒力因子及其致病机制又存在差异，临床研究中，应查明具体的致病性CNS 菌种以及它们确切的作用机制，这虽然任重道远，但对于防控医院和社区获得性CNS 感染及人畜共患病的传播意义重大，将极大提高人们的医疗和健康水平。因此，如何更加高效和准确地对CNS 进行检测和鉴定将会是未来研究的方向，同时应对不同种类CNS 致病因子进行深入的研究。目前，哪些因子真正参与了CNS 对机体的致病性并以何种方式参与仍不清楚，这将会是未来一段时期内科学家亟需解决的关键问题。因为CNS 已经对人类健康、兽医临床和食品安全等领域造成了巨大威胁和挑战，所以深入开展CNS 致病因子与毒力因子作用机制研究显得尤为重要。