TRIM9 基因调控牛支原体脂质相关膜蛋白诱导EBL 细胞IL-1β表达的研究

赵雅芝，潘 巧，王显兵，郝文君，刘 桐，王秀梅*，辛九庆*

（1. 吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物支原体病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

牛支原体（Mycoplasma bovis，M. bovis）是现有的最小的原核微生物，无细胞壁，可以通过0.22 μm滤器[1]，是一种宿主特异性粘膜常在菌，感染能够引起犊牛的肺炎、关节炎及奶牛乳房炎等疾病[2]，且常常与其它病原体混合感染导致病情复杂持久不愈，是危害我国养牛业健康发展的重要因素之一。支原体表面有丰富的脂质相关膜蛋白（Lipid-associated mem⁃brane proteins，LAMPs），其能够介导支原体黏附感染宿主，调节宿主的免疫系统[3]，其通过与TLRs 相互作用在炎症反应的起始中起重要作用[4]。本研究从前期获得的转录组测序数据中[5]，分析了M.bovis LAMPs 刺激前后EBL 细胞差异表达的基因，发现M. bovis LAMPs 刺激后EBL 细胞上调表达TRIM9 基因。TRIM9 基因属于三结构域蛋白（Tripartitemotif，TRIM）家族，该家族蛋白存在于所有多细胞动物体内，目前包含70 多个成员。越来越多的证据表明，许多TRIM 家族蛋白与抗感染免疫相关[6]。最近有文献报道TRIM9 与NF-κB 信号通路的调控相关[7-8]。而以前的文献报道表明M.bovis LAMPs 能够通过NF-κB信号通路诱导EBL 细胞释放IL-1β[9]。为探究TRIM9基因在M.bovis LAMPs 刺激EBL 细胞释放IL-1β中的作用，本研究构建TRIM9 基因过表达和敲低的EBL细胞模型，采用qPCR，ELISA 和western blot 等试验方法，解析了TRIM9 基因在M.bovis LAMPs 诱导EBL细胞释放IL-1β中积极调控的作用，为宿主基因调控M.bovis LAMPs 诱导的天然免疫应答机制提供理论依据，同时也为后期疫苗研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料M.bovis 牛2c 株、EBL 细胞、M.bovis LAMPs、NP-40、pEGFP-C1 质粒均由本实验室保存；pCMV-C-HA 质粒购自碧云天公司。BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司；限制性内切酶BamH I 与Sal I 购 自NEB 公 司；Prime STAR Max Pre⁃mix（2×）购自TaKaRa 公司；DMEM/HIGH GLUCOSE购自HyClone；Plasmid Mini Kit I、Gel Extraction Kit购自OMEGA 公司；Simply P 总RNA 提取试剂盒购自博日公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR®Green Master（ROX）购自Roche 公 司；TransIT-X2®System 购 自Mirus 公 司；Bovine Interleukin 1 Beta ELISE Kit 购自MYBioSource公司。

1.2 引物设计和合成参考GenBank 中GAPDH（AC_000162），IL-1β（NM_174093）和 牛 源TRIM9（NM_001076537）基因mRNA 序列，采用Primer Pre⁃mier 5.0 软件和CE DesignV1.03 软件设计qPCR 及PCR引物，TRIM9 基因序列特异性引物两端分别加入BamH I 和Sal I 酶切位点，引物信息见表1，以上引物均由华大基因科技有限公司合成。委托SIGMA 公司设计合成TRIM9 基因干扰引物si-TRIM9。

1.3 TRIM9 和IL-1β基因表达的检测将生长至对数期的EBL 细胞以1×109个/cm2的密度接种于12 孔细胞培养板，待细胞长至80%～90%时，依据实验室前期摸索M. bovis LAMPs 刺激EBL 细胞的最佳条件[9]，加入终浓度2 μg/mL 的M.bovis LAMPs，设置空白对照，5%CO237 ℃诱导培养12 h 后收集细胞，利用Simply P总RNA提取试剂盒提取RNA，经Transcrip⁃tor First Strand cDNA Synthesis Kit 将RNA 反转录为cD⁃NA，并以cDNA 为模板采用1L-1β-F/R 和TRIM9-RTF/R引物，利用qPCR方法分别检测M.bovis LAMPs刺激后EBL 细胞中TRIM9 和IL-1β的相对表达量，实验设GAPDH（AC_000162）为内参基因，qPCR 反应条件：95 ℃10 min；95 ℃15 s、60 ℃1 min，40个循环；95 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃1 s。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.4 TRIM9 亚细胞定位检测以1.3 中方法制备EBL 细胞基因组cDNA 作为为模板，采用TRIM9-GFP-F/R 引物，利用PCR 方法扩增TRIM9（扩增条件为：95 ℃5 min；95 ℃30 s、61 ℃30 s、72 ℃30 s，40 个循环；72 ℃10 min），并回收目的片段，连接于BamH I 与Sal I 双酶切处理纯化的pEGFP-C1 载体，构建绿色荧光融合质粒pEGFP-C1-TRIM9，双酶切和测序鉴定阳性质粒（终浓度2 μg/mL）转染EBL细胞，对照组转染pEGFP-C1 质粒，每组设置3 个样品，重复3 次实验，24 h 后用1 mL PBS 洗3 次，10 min/次，然后加入1 mL 的4%多聚甲醛，室温固定15 min，PBS 洗3 次，加入0.5%Triton-X-100 室温穿 孔15 min，PBS 洗3 次，加入DAPI 染色15 min，利用高分辨率活细胞共聚焦显微镜观察TRIM9 在EBL 细胞中的定位。

1.5 过表达质粒pCMV-C-HA-TRIM9 转染EBL 细胞的最佳剂量确定按照1.4 中方法采用TRIM9-CHA-F/R引物，构建过表达质粒pCMV-C-HA-TRIM9，将不同浓度的过表达质粒pCMV-C-HA-TRIM9（1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL 和8 μg/mL）分别转染EBL 细胞，以pCMV-C-HA 质粒转染EBL 细胞作为对照，36 h 后利用ELISA 检测试剂盒检测培养基中IL-1β的释放量。同时收集细胞，按1.3中方法提取基因组制备cDNA，并以cDNA为模板，以1L-1β-F/R 为引物，GAPDH（AC000162）为内参基因，按照1.3 中qPCR 方法检测EBL 细胞中IL-1β相对表达量，重复3次实验，以引起IL-1β最高表达量且对EBL细胞影响轻微的转染剂量作为最佳剂量。

1.6 过表达及敲低TRIM9 对M. bovis LAMPs 刺激EBL 细胞释放IL-1β的影响将最佳剂量过表达质粒pCMV-C-HA-TRIM9 和si-TRIM9 分别转染EBL 细胞，同时分别转染pCMV-C-HA 和对照siRNA 作为对照组，在5%CO237 ℃培养24 h后加入终浓度2 μg/mL的牛支原体LAMPs 继续培养12 h，重复3 次实验，利用qPCR 检测IL-1β相对表达量，同时利用Bovine Interleukin 1 Beta ELISE Kit 检测EBL 细胞IL-1β的释放量。

1.7 NF-κB 信号通路激活水平检测NF-κB 由p50 亚基和p65 亚基组成，p65 亚基进核和磷酸化是激活NF-κB 信号通路的标志。为分析TRIM9 在NF-κB 信号通路中的作用。本试验检测了TRIM9 过表达及敲低时LAMPs 刺激EBL 细胞后的p65 磷酸化水平。以1.5 中确定的pCMV-C-HA-TRIM9 最佳浓度和si-TRIM9 分别转染EBL 细胞，5% CO237 ℃培养24 h 后加入终浓度2 μg/mL 的牛支原体LAMPs 继续培养12 h，同时设只加入转染试剂组和LAMPs刺激组为对照组。NP-40 裂解细胞获取总蛋白，以抗p-p65（1:1 000）抗体为一抗，以山羊抗兔IgG（1:10 000）荧光抗体为二抗，进行western blot 检测，利用Odys⁃sey®红外扫描仪扫描NC 膜，使用Image studio 软件对结果进行灰度值分析，检测p65 磷酸化水平，本实验重复3 次。

2 结 果

2.1 M. bovis LAMPs 刺激对EBL 细胞中TRIM9 和IL-1β基因转录水平的影响M. bovis LAMPs 刺激EBL 细胞后，采用qPCR 方法对TRIM9 和IL-1β基因的mRNA 表达量进行检测，结果显示与对照组相比TRIM9 mRNA 表达量上调2.9 倍（图1A），与本实验室前期获得的转录组测序数据[5]分析相符；IL-1β mRNA表达量也上调2.6 倍（图1B）。表明TRIM9 基因可能与M.bovis LAMPs刺激EBL 细胞释放IL-1β相关。

图1 qPCR 检测LAMPS 刺激后EBL 细胞TRIM9(A)和IL-1β(B)的相对表达量Fig.1 The relative expression of TRIM9 and IL-1β in EBL cells stimulated by M.bovis LAMPs was detected by qPCR

2.2 TRIM9 蛋白在EBL 细胞中的定位检测结果以EBL 细胞基因组cDNA 为模板，PCR 扩增TRIM9基因，构建绿色荧光融合质粒pEGFP-C1-TRIM9，酶切鉴定结果显示得到约2 100 bp 大小的目的片段，大小与预期相符（图2）；测序结果与NCBI 参考序列（NM_001076537）的同源性100%。表明正确构建了绿色荧光融合质粒pEGFP-C1-TRIM9。

图2 pEGFP-C1-TRIM9 重组质粒双酶切鉴定Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant plasmid pEGFP-C1-TRIM9

将绿色荧光融合质粒pEGFP-C1-TRIM9 转染EBL细胞，利用高分辨率活细胞共聚焦显微镜LSM800-ZEISS 观察可见，对照组细胞中无明显绿色荧光，而转染pEGFP-C1-TRIM9质粒的EBL细胞胞浆中呈现绿色荧光，细胞核仅蓝色荧光，重复实验结果一致，表明TRIM9蛋白能够瞬时表达于EBL细胞的胞浆中。

图3 高分辨率活细胞共聚焦显微镜TRIM9 亚细胞定位Fig.3 The subcellular observation of TRIM9 by LSM800

2.3 过表达质粒pCMV-C-HA-TRIM9 转染EBL 细胞的最佳剂量将鉴定阳性的过表达质粒pC⁃MV-C-HA-TRIM9（图略）以不同浓度梯度转染EBL细胞，利用qPCR 和ELISA 法分别检测IL-1β的表达量，结果显示，转染过表达质粒pCMV-C-HATRIM9 后EBL 细胞中IL-1β表达量高于对照组，且两者呈剂量依赖性，当转染的pCMV-C-HA-TRIM9质粒终浓度为4 μg/mL 时IL-1β表达量最高，由此确定重组质粒的最佳转染剂量为4 μg/mL（图4）。

图4 qPCR(A)和ELISA(B)方法检测过表达TRIM9 基因后EBL 细胞IL-1β的相对表达量Fig.4 The relative expression of IL-1β in EBL cells after overexpression of TRIM9 gene was detected by qPCR(A)and ELISA(B)

2.4 敲低以及过表达TRIM9 后EBL 细胞中IL-1β检测结果为确定TRIM9 对IL-1β表达的影响，分别将si-TRIM9 和过表达质粒pCMV-C-HA-TRIM9 转染EBL 细胞，经M.bovis LAMPs 刺激，利用qPCR 和ELISA 检测敲低和过表达TRIM9 时IL-1β的表达量，结果显示，与对照组相比，转染si-TRIM9后TRIM9显著下调表达（p<0.001），而转染过表达质粒pCMV-CHA-TRIM9 后TRIM9 显著上调表达（p<0.001）（图5A），表明已将TRIM9 基因在EBL 细胞中敲低及过表达。qPCR 检测结果显示，与对照组相比，LAMPs 刺激后正常细胞中IL-1β上调2.4 倍，敲低TRIM9 后，细胞中IL-1β上调33 倍，而过表达组中IL-1β上调2.3 倍（图5B）；ELISA 检测结果显示LAMPs 刺激后正常细胞中IL-1β上调2.9 倍，敲低组EBL 细胞IL-1β释放量上调30倍，而过表达组EBL细胞IL-1β释放量上调2.9倍（图5C），与qPCR 结果趋势一致。以上结果表明过表达TRIM9 基因对IL-1β表达无影响，而敲低TRIM9基因可促进IL-1β表达。

图5 敲低及过表达TRIM9 基因后EBL 细胞TRIM9(A)和IL-1β(B,C)的相对表达量Fig.5 The relative expression of TRIM9 and IL-1β in EBL cells after knockdown and over-expression of TRIM9 gene

2.5 NF-κB 信号通路检测结果分别检测了敲低和过表达TRIM9 基因后EBL 细胞中p65 磷酸化水平。结果显示，与对照组相比，敲低TRIM9 后EBL细胞中p65 磷酸化水平显著升高（p<0.01），而过表达TRIM9 蛋白后EBL 细胞中p65 磷酸化水平无明显变化（图6）。表明过表达TRIM9 后牛支原体LAMPs不诱导NF-κB 信号通路激活；而敲低TRIM9 后牛支原体LAMPs 能够促进p65 磷酸化水平提高从而激活NF-κB 信号通路。

图6 Western blot 检测敲低及过表达TRIM9 基因后EBL 细胞中p65 磷酸化(A)和灰度值分析(B)Fig.6 Detection of p65 phosphorylation(A)and gray value analysis(B)of p65 phosphorylation in EBL cells after knockdown and over expression with TRIM9 gene by western blot

3 讨 论

前期研究表明M. bovis LAMPs 通过NF-κB 信号通路诱导EBL 细胞释放IL-1β[9-10]，引发EBL 细胞的炎性反应，但EBL 细胞中参与M.bovis LAMPs 引起的炎性反应的相关基因尚不明确。本实验通过对前期获得的转录组数据[5]分析，筛选出可能参与调控NF-κB 信号通路的TRIM9 基因，通过参考GenBank中TRIM9 的序列设计引物，采用qPCR 方法验证，结果表明M.bovis LAMPs 刺激EBL 细胞增强IL-1β表达的同时，TRIM9 基因也上调表达。相关文献报道TRIM 家族基因参与多种细胞功能，包括调节先天免疫反应[6]，TRIM9 最初被认为主要存在于胚胎和成人大脑内，调控神经元的发育成熟[11-12]。本研究通过亚细胞定位证明TRIM9基因能够在EBL细胞内表达。为了探究TRIM9 基因是否参与及调控M. bovis LAMPs 诱导EBL 细胞IL-1β的释放，采用qPCR 和ELISA 方法检测过表达和敲低TRIM9 基因后M.bovis LAMPs 刺激EBL 细胞引起IL-1β表达情况，结果显示当TRIM9 基因过表达时EBL 细胞中IL-1β表达量无明显变化，而敲低TRIM9 基因后EBL 细胞IL-1β表达量上调。表明敲低TRIM9 基因促进M. bovis AMPs 诱导EBL 细胞释放IL-1β。为验证此过程是否通过NF-κB 信号通路，采用western blot 方法检测了同样实验条件下NF-κB 信号通路激活水平，发现过表达TRIM9 基因后M. bovis LAMPs 刺激EBL 细胞中p65 磷酸化水平与对照组相比无明显变化；而敲低TRIM9 后检测到刺激后的EBL 细胞中p65 磷酸化水平明显升高，表明敲低TRIM9 基因促进M. bovis AMPs 诱导NF-κB 信号通路激活。由此表明，敲低TRIM9，促进M. bovis LAMPs 诱导EBL 细胞中NF-κB信号通路的激活，从而促进其IL-1β的释放。Liu Y等发现牡蛎中TRIM9 同源物参与负调控NF-κB 活动[7]，Shi M 等的研究也显示TRIM9 磷酸化残基与β-TrCP的重复区WD 40 的相互作用阻止了β-TrCP 与底物结合，稳定IκBα和P100，从而阻断NF-κB 的激活直接影响NF-κB 诱导的炎性细胞因子的产生[8]，文献资料说明TRIM9 能够阻断NF-κB 的激活，本实验中敲低TRIM9 基因后M.bovis LAMPs 刺激细胞试验结果，与之前的文献结果相一致，但是正向的过表达TRIM9 基因后M.bovis LAMPs 刺激细胞试验，并未验证该阻断效应。推测一方面可能与2 μg/mL M.bovis LAMPs 刺激IL-1β的释放量不高，过表达TRIM9 基因阻断效应不明显，另一方面可能可能与TRIM9 基因过表达模型构建不适当相关。今后研究也将继续针对该部分实验进行进一步验证和探索。综上所述，本研究对TRIM9 在调控M.bovis 诱导宿主细胞免疫应答反应中的机制初步探究，解析宿主基因调控M.bovis 引起宿主细胞免疫应答反应的机制，为开展进一步研究奠定基础。