中国蓝舌病病毒血清2 型病毒株的分离与鉴定

朱 沛，李占鸿，谢佳芮，牛保生，姚萍芬，朱建波，肖 雷*，李华春*

（1. 云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224；2. 云南省师宗县动物疫病控制中心，云南 师宗 655700）

蓝舌病（BT）是由呼肠孤类病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒（BTV）引起的非接触性虫媒病毒病[1-2]，BTV 为双链RNA 病毒，基因组大小约为20 kb，由Segment1（Seg-1）～Segment10（Seg-10）10 个 节 段 组成，可编码7 种结构蛋白（VP1～VP7）和5 种非结构蛋白（NS1～NS3、NS3a、NS4）[3]，其中VP7 是BTV 内衣壳的结构蛋白[4]，决定了BTV 的群特异性，不同血清型BTV 的VP7 蛋白氨基酸序列的相似度可达94%以上[5]；而VP2 由L2 基因编码，在不同血清型的病毒之间保守性最低，其氨基酸序列在不同血清型病毒株间的差异在22.7%（BTV-4 与BTV-20）至72.9%（BTV-6与BTV-22）[6]，VP2 是诱导BTV 产生特异性中和抗体的主要蛋白，决定了BTV 的血清型，迄今全球已确认的血清型共有27 个（BTV1～BTV27）[7-9]。

动物感染BT 后表现为发热、黏膜水肿、鼻腔及胃肠黏膜严重卡他性炎症，伴随舌头发绀，以绵羊和牛最易感，动物感染BTV 的平均死亡率为30%，绵羊高达80%[10]，该病对牛羊养殖业造成的经济损失严重，据估计全球每年仅因BT 而导致的经济损失高达30 亿美元[11]，BTV 血清型众多，不同血清型之间交叉保护弱，给BT 的防控带来了严峻的挑战，该病目前没有很好的预防办法，世界动物卫生组织（OIE）将BT 列为法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。自1979 年张念祖等人首次从云南分离到BTV 后，全国范围内陆续分离到7 个血清型的BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16），此外2012年肖雷等从云南省师宗县牛血液中分离到一株BTV-5[12]，2013 年李占鸿等从云南省芒市分离到一株BTV-9，2014年吕敏娜等从广东省牛血液中分离一株BTV-7[13]，虽然前期血清学调查显示中国部分地区存在BTV-2 的流行，但甚少有BTV-2的分离报道，本实验室从2017 年6 月师宗县牛的抗凝血中分离到一株BTV-2，并对分离株的Seg-2及Seg-7序列的遗传特性进行分析，为开展BTV-2 在中国的流行趋势、遗传特性以及致病性的深入研究奠定了良好基础。

1 材料与方法

1.1 监控点及样品采集从气候条件、海拔高度等因素综合考量，选择云南省师宗县、江城县及芒市镇作为监控点，采取竞争ELISA 方法检测牛羊BTV 抗体情况，筛选BTV 抗体阴性的10 头牛和5 只羊作为哨兵动物，每年5 月至10 月每周采血一次，11 月至次年4 月每月采血一次。每次采集一份无抗凝剂全血和一份肝素钠抗凝血，并及时送至实验室开展病毒检测及分离工作。

1.2 主要试剂BTV 竞争ELISA（C-ELISA）抗体检测试剂盒、仓鼠肾细胞（BHK-21）、蚊子细胞（C6/36）、BTV 标准株及其标准血清均由云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室提供；E.coli DH5α感受态细胞、DNA 胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；病毒RNA 提取试剂盒、PrimeScript One Step RT-PCR 试剂盒、pMD18-T载体、DNA Marker 均购自TaKaRa 公司。

1.3 哨兵动物血清BTV 抗体检测参照BTV C-ELISA 抗体检测试剂盒说明书检测2017 年监控动物血清样品共1350 份。

1.4 哨兵动物血液BTV 的检测取哨兵动物BTV抗体转阳时间点前后两周的抗凝血200 μL，用1 mL灭菌PBS 洗涤3 次后，离心弃上清，1 mL 超纯水使红细胞裂解，按病毒RNA 提取试剂盒说明书提取病毒总RNA，RNA 经95 ℃变性5min 后，以其作为PCR 检测的模板。针对BTV 最保守的VP7 设计引物，BTV-S7-F：5'-GTAAGTGTAATCTAAGAGA-3'；BTV-S7-R：5'-GTAAGTTTAAATCGCAAGACG-3'，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。RT-PCR 反应条件为：45 ℃40 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃60 s，40 个循环，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测；并以本实验室建立的BTV 高通量Real-Time qRT-PCR 方法进行BTV 核酸检测。

1.5 病毒分离与电镜观察取核酸检测为BTV 阳性的抗凝血红细胞200 μL，静脉接种于10 日龄健康鸡胚中，每枚鸡胚接种0.1 mL，37 ℃孵化箱培养，废弃24 h 内死亡的鸡胚，收集24 h～120 h 死亡的鸡胚肝脏，加入1 mL 灭菌MEM 研磨，取200 μL 接种于25 cm2的C6/36 细胞培养瓶里，37 ℃培养6 d 后，取1 mL 培养液上清在BHK-21 上继续盲传3 代，当出现细胞病变（CPE）时，收获细胞上清，超速离心后取沉淀，用PBS 溶解过夜后滴加于铜网上，使用磷钨酸进行负染，在电镜下观察病毒粒子的形态，并参照文献方法对分离到的病毒进行TCID50的测定[14]。

1.6 病毒的群特异性鉴定按照1.4 中的方法特异性扩增1.5 中BTV 分离株的Seg-7 序列，对BTV 的群特异性进行鉴定。

1.7 病毒的血清型鉴定VP2决定BTV的血清型，扩增1.5 中分离病毒的Seg-2 序列，50 ℃30 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃90 s，40 个循环，PCR产物经胶回收后，连接pMD18-T载体，并转化于E.coli DH5α感受态细胞中，重组菌株经PCR 鉴定后，由昆明硕擎生物科技有限公司测序，通过MEGA 6 软件对分离病毒株的Seg-2 序列与GenBank 部分病毒株Seg-2 标准序列进行比对并构建进化树。

1.8 微量中和试验由于Seg-2 编码的VP2 在同一血清型中仍存在较大差异[6]，因此根据血清型设计的引物往往无法对同一型的所有BTV 进行有效扩增，而BTV 血清型之间缺乏交叉保护，所以中和试验一直作为经典的型鉴定方法在使用。为进一步明确分离病毒株的血清型，本研究分别进行了分离株与BTV 标准血清的微量中和试验和分离株对应血清与BTV 标准病毒的微量中和试验，通过血清学试验进一步鉴定分离株的血清型。

2 结 果

2.1 哨兵动物血清BTV 抗体检测通过C-ELISA方法检测2017 年全年的监控群血清，结果显示6 月27 日师宗县哨兵动物2 号牛BTV 抗体转阳。

2.2 哨兵动物血液BTV 的检测提取哨兵动物红细胞RNA，经RT-PCR 检测结果显示，2 号牛转阳当周及前后一周的核酸均为阳性，提示其中可能含有BTV，传代后取上清，qRT-PCR 结果显示转阳前一周抗凝血的Ct 值最小，提示其中病毒含量最高，分离到BTV 的可能性最大（表1）。

表1 监控动物BTV ELISA 及qRT-PCR 结果Table 1 BTV ELISA and quantitative real-time PCR results of the Monitoring animals

2.3 病毒分离与电镜观察核酸检测为BTV 阳性的抗凝血样品经静脉接种鸡胚后，鸡胚出现死亡，剖解后发现鸡胚全身出血，收集死亡鸡胚肝脏，研磨后接种C6/36 细胞，培养6 d 后取上清1 mL 接种于BHK-21 细胞，盲传到第3 代时，细胞出现明显CPE，出现皱缩，崩解，脱落，qRT-PCR 检测结果为BTV 阳性（Ct 值19.2）。表明分离到的病毒株为BTV，命名为YN/SZ/22457，在电镜下观察病毒呈球形无囊膜，直径约为70 nm，病毒粒子表面分布有大量的纤维状突起（图1），参照文献方法[14]，测定该病毒的效价为10-4.88TCID50/50 μL。

2.4 Seg-2 与Seg-7 基因扩增及序列分析分别扩增分离株YN/SZ/22457 的Seg-2 及Seg-7 序列，结果显示，分别在2 237 bp和1 093 bp处有目的条带（图2），片段大小符合预期，进一步表明该分离株为BTV。分离株Seg-2 及Seg-7 序列测序后进行比对并构建进化树，结果显示分离株YN/SZ/22457 的Seg-2 序列和日本病毒株BTV-2（AB686224）以及台湾病毒株BTV-2（AY493687）的Seg-2 序列相似度较高，且位于同一分支上（图3），表明分离株为BTV-2 型；分离株YN/SZ/22457 的Seg-7 序列与与台湾病毒株BTV-2（AY493692）以及日本病毒株BTV-21（AB473807）亲缘关系最近，同为Eastern 2 型（图4）。

2.5 微量中和试验本研究在BHK 细胞进行YN/SZ/22457 对应血清与27 个型BTV 标准病毒的微量中和试验，结果显示经1:10 稀释后，YN/SZ/22457 对应血清对BTV-2、BTV-22、BTV-23 的100 TCID50存在保护，进一步稀释结果显示，当1:40 稀释时，YN/SZ/22457 对 应 血 清 对BTV-22、BTV-23 不 再 保护，而当1:160 稀释时，仍对BTV-2 型标准毒有保护作用；同时，本研究用100 TCID50的YN/SZ/22457与BTV-2、BTV-22、BTV-23 标准血清进行微量中和试验，结果显示YN/SZ/22457 仅对BTV-2 型标准血清存在中和作用，中和效价为1:80，进一步从血清学上验证了分离株YN/SZ/22457 为BTV-2 型。

图1 BTV 分离株YN/SZ/22457 的电镜观察Fig.1 Electron microscopic observation of isolated BTV strain YN/SZ/22457

图2 YN/SZ/22457 的RT-PCR 鉴定Fig.2 Identification of YN/SZ/22457 by RT-PCR

图3 YN/SZ/22457 株Seg-2 基因序列系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on the Seg-2 sequences of the YN/SZ/22457 strain

图4 YN/SZ/22457 株Seg-7 基因序列系统进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on the Seg-7 sequences of the YN/SZ/22457 strain

3 讨 论

BTV 是一种虫媒病毒，它的传播需要病原、媒介以及宿主，由于BTV 初次分离株在细胞培养上不敏感，因此选择鸡胚静脉接种的方式接种哨兵动物抗凝血，在前期研究发现BTV 在蚊子细胞（C6/36）中能快速增殖但不产生明显病变，因此本研究采用“鸡胚-C6/36 细胞-BHK-21 细胞”接种方式，以高效分离病毒，最终从2017 年师宗县BTV 抗体阳性的牛抗凝血中分离到一株BTV-2，此外本实验室通过建立监控点，并对哨兵动物定期采血的方式在云南省多个地区成功分离到多株虫媒病毒，该方法对其他病毒的分离具有指导意义。

自1979 年，张念祖等首次从云南省师宗县分离到BTV，2012 年肖雷等又从师宗县分离到67 株BTV[15-16]，表明师宗县为BTV 高发地区，在该地设立监控点能够提高BT 的自然感染几率；从分离到的病毒株来看，当地BTV-1 和BTV-16 为主流血清型，本研究于2017 年从师宗县哨兵动物血液中分离到BTV-2，新血清型的出现提示了BT 的风险，这可能和当地媒介的变化和动物的流通有关；此前，BTV-2 曾在美国、澳大利亚及以色列分离到，2000年曾在北非流行，而我国甚少有BTV-2 型的报道。

BTV 基因组由Segment1～Segment10 这10 个节段组成[3]，本研究选择Seg-2 编码的VP2 以及Seg-7 编码的VP7 进行测序分析。VP2 决定了BTV 的血清型，对不同地域分离的同一血清型BTV 株的Seg-2序列分析表明，Seg-2 序列的变异在一定程度上体现着病毒的地域特征，并可据此将同一血清型病毒株分为Eastern 型与Western 型[17]。通过对分离株YN/SZ/22457 的Seg-2 序列做系统发生分析，分离株的Seg-2 序列和日本以及台湾BTV-2 株的Seg-2 序列相似度最高，亲缘关系最近，表明分离株为BTV-2型，也意味着流行于中国、日本、台湾的BTV-2 株有着相同的起源，同为Eastern 型，但新出现的血清型来源还有待进一步深入研究。研究对Seg-7 序列的进化分析显示，分离株YN/SZ/22457 的Seg-7 序列与台湾株BTV-2（AY493692）以及日本病毒株BTV-21（AB473807）亲缘关系最近，同东方型中的Eastern2亚型。

云南省地处中国西南边陲，与周边多个国家接壤，跨境动物传播疫病的风险大，同时覆盖多种气候环境，一些地区常年温暖湿润，给虫媒病毒的媒介提供了滋养环境，所以云南省在虫媒病毒防控及跨境动物疫病风险控制方面面临巨大挑战，本研究首次报道了云南地区BTV-2 的分离鉴定，并分析了分离株Seg-2 和Seg-7 的序列特征，研究结果将为进一步掌握云南省BTV 血清型的流行情况、致病性、遗传特性奠定基础，也将为全国范围内虫媒病毒的监测与防控工作提供重要参考。