CAT、CYBA及NIK基因与慢性阻塞性肺疾病及相关肺动脉高压易感性的关系*

谢欣芸， 耑 冰， 苑 群， 王 曦， 李 萍， 谢 骏， 杨 朝△

（1西北民族大学第一附属医院，宁夏回族自治区人民医院院本部呼吸内科，宁夏银川750011；2南京医科大学附属苏州科技城医院呼吸科，江苏苏州215153）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一种患病率和致死率均较高的呼吸道疾病，其中肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是COPD 常见的并发症及主要的致死原因之一。随着环境的改变，COPD 患病率逐年增加，已逐渐成为全球性问题。世界卫生组织的研究表明，COPD 的死亡率居全球致死性疾病的第5位［1］，PH 致死率也随之升高。

氧化应激机制在驱动COPD 及相关PH 中起着关键作用。p22phox又称细胞色素b-245 α 多肽（cytochrome B-245 alpha polypeptide，CYBA），是由CYBA基因编码的普遍存在的蛋白质，是产生超氧化物的NADPH 氧化酶（NADPH oxidases，NOXs）的关键成分［2］。p22phox表达增加可激活 NOXs 的生成，导致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增多，继而激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信号通路，引起氧化应激损伤。NF-κB 诱导激酶（NF-κB-inducing kinase，NIK）的积累是NF-κB信号通路中的关键事件，可导致NF-κB 增加。王萍等［3］观察到 NF-κB 蛋白与肺血管重塑程度呈正相关，因此可导致肺血管相关疾病。过多的ROS 可由过氧化氢酶（catalase，CAT）分解，以减少氧化应激损伤。目前已有研究表明，CYBA基因 rs1049255 和 rs9932581 位点、CAT基 因 rs1001179 和 rs7943316 位 点 及NIK基 因rs7222094 位点的点突变可导致氧化/抗氧化能力改变，从而介导心血管、呼吸等系统疾病的发生。因此，本研究通过病例-对照研究，探讨CYBA、CAT及NIK基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与COPD 及相关PH 发病易感性的关系，为进一步阐明遗传易感基因在COPD 及相关PH 发生发展中的作用机制提供依据。

材 料 和 方 法

1 研究对象纳入标准

连续选取2016年11月～2018年5月就诊于宁夏回族自治区人民医院院本部汉族稳定期COPD 患者250 例作为病例组，选取同期我院127 例汉族健康体检者为对照组。所纳入COPD 患者符合2013 年《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》诊断标准［第1 秒用力呼气 容 积（forced expiratory volume in one second，FEV1）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）＜70%］［4］。根据超声心动图测得的肺动脉收缩压（pulmonary artery systolic pressure，PASP）将COPD组分为 COPD 相关 PH 组（PASP≥50 mmHg）和 COPD 非PH 组（PASP＜50 mmHg）。PH 诊断根据2015 年国际超声心动图PH 的诊断标准（三尖瓣返流速度＞3.4 m/s，PASP≥50 mmHg）［5］。排除标准:胸腔积液、肺间质疾病等引起的限制性通气障碍及支气管哮喘；恶性肿瘤；贫血等血液疾病；糖尿病等内分泌疾病；冠状动脉粥样硬化性心脏病、先天性心脏病等心血管系统疾病；自身免疫性疾病；严重的肝、肾功能损伤；静脉药物滥用、使用抑制食欲药物（如右芬氟拉明、阿米雷司及其衍生物等）引起的PH。所有受试者均遵循自愿原则，已签署知情同意书，并经过我院伦理委员会批准。

2 研究方法

2.1 DNA 提取 抽取受试者禁食后晨起静脉血4 mL，置于EDTA 抗凝管内抗凝，严格按照AxyPrep 血基因组DNA 小量试剂盒（Axygen）说明书操作，测定DNA浓度后置于-80℃保存备用。

2.2 引物制备 引物设计使用Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design 软件，并交由北京博奥晶典生物技术有限公司合成。rs1001179 位点的上游引物序列为5'-ACGTTGGATGCAGCAATTGGAGAGCCTCG-3'，下游引物序列为5'-ACGTTGGATGCTGAAGGATGCTGATAACCG-3'，延伸引物序列为5'-GCCCTGGGTTCGGCTAT-3'；rs7943316 位点的上游引物序列为5'-ACGTTGGATGATTGGCTGAGCCTGAAGTCG-3'，下游引物序列为5'-ACGTTGGATGTCCACCCTCAGCAGGCAAAT-3'，延伸引物序列为5'-gaaagCTGCCTGTTGCCCCGAG-3'；rs1049255 位点的上游引物序列为5'-ACGTTGGATGTCGTGTGACCTCGCCCCGGA-3'，下游引物序列为5'-ACGTTGGATGCCCCAGGCAGAGGCTCACG-3'，延伸引物序列为5'-GCAGGTGGGTGCACCTGG-3'；rs9932581 位点的上游引物序列为5'-ACGTTGGATGGTCACTCAGAGCAGGAACC-3'，下游引物序列为5'-ACGTTGGATGCGGTGGCCATGGGGAATAAA-3'，延伸引物序列为5'-TGGCCATGGGGAATAAACCAGCATT-3'；rs7222094位点的上游引物序列为5'-ACGTTGGATGTGCTCGTCTGTTACCTCTCT-3'，下游引物序列为5'-ACGTTGGATGAAGTGCACAGATGGTGGATG-3'，延伸引物序列为5'-CTGCTCCAGTCACGATGGGCACAG-3'。

2.3 测序验证 使用5 管经二代测序（南京金斯瑞生物科技有限公司）验证的CYBA基因rs1049255 和rs9932581 位点、CAT基因 rs1001179 和 rs7943316 位点 及NIK基因 rs7222094 位点 SNP 的人类 DNA 作为阳性对照，5 管鲑鱼精DNA 作为阴性对照，混杂在待测DNA 样本中进行SNP 分型，最后结果完全匹配率接近100%。

3 统计学处理

统计分析采用SPSS 19.0 软件。以Hardy-Weinberg 平衡定律评估样本的群体代表性。直接计数法统计各位点的基因型频率与等位基因频率（%）。基因型频率、等位基因频率的对比采用χ2检验。用logistic回归方法计算优势比（odds ratio，OR）及其95%置信区间（confidence interval，CI），评估各位点基因多态性是否会影响COPD及相关PH的发病率。

结 果

1 临床资料

本研究共纳入 COPD 患者 250 例，其中 COPD 非PH 组 147 例，COPD 相关 PH 组 103 例，健康对照组127 例。年龄、性别和吸烟指数在COPD 组与健康对照组、COPD 非 PH 组与 COPD 相关 PH 组间差异无统计学显著性，见表1。

表1 健康对照者及COPD组、COPD非PH组和COPD相关PH组患者的临床资料Table 1.Clinical characteristics of the healthy controls（control group），and the patients in COPD，COPD without PH and COPD with PH groups

2 Hardy-Weinberg平衡检验

CYBA基 因 rs1049255 和 rs9932581、CAT基 因rs1001179和rs7943316及NIK基因rs7222094位点的基因型在各组间分布均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群体代表性，见表2～4。

表2 CYBA基因rs1049255和rs9932581位点的基因型在各组间的Hardy-Weinberg平衡检验Table 2.Hardy-Weinberg equilibrium of CYBA gene rs1049255 and rs9932581 loci in the studied groups

表3 CAT基因rs1001179和rs7943316位点基因型在各组间的Hardy-Weinberg平衡检验Table 3.Hardy-Weinberg equilibrium of CATgene rs1001179 and rs7943316 loci in the studied groups

表4 NIK 基因rs7222094 位点基因型在各组间的Hardy-Weinberg平衡检验Table 4.Hardy-Weinberg equilibrium of NIK gene rs7222094 locus in the studied groups

3 在健康对照组与COPD 组之间对比CAT、CYBA和NIK基因所纳入SNP位点基因型及等位基因频率的分布情况

在健康对照组与COPD 组之间，rs1001179 位点基因型及等位基因频率分布的差异有统计学意义（P＜0.05），而 rs1049255、rs9932581、rs7943316 和rs7222094 位点基因型及等位基因频率分布的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表5。

4 在 COPD 非 PH 组与 COPD 相关 PH 组之间对比CAT、CYBA 和 NIK 基因所纳入 SNP 位点基因型及等位基因频率的分布情况

在 COPD 非 PH 组 与 COPD 相 关 PH 组 之 间 ，rs1049255 位点基因型及等位基因频率分布的差异有统计学显著性（P＜0.05），rs7222094 位点等位基因频率分布的差异有统计学显著性（P＜0.05），而rs7222094 位点基因型，以及 rs1001179、rs9932581 和rs7943316 位点基因型及等位基因频率分布的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表6。

讨 论

CAT 主要通过降解过氧化氢生成氧气和水来抵抗氧化损伤，在人体中所有主要身体器官中都有表达。当短时间内ROS 产生过多时，主要由CAT 发挥抗氧化作用，以维持氧化/抗氧化平衡［6］。而CAT基因单个位点的核苷酸变异可影响其表达水平，使其活性降低，抗氧化能力减弱，导致氧化应激增强，可能参与如肺癌、前列腺癌等的发生。但这种多态性的效果似乎并非在所有研究中呈现一致的方向性。rs1001179 位点位于CAT基因启动子区域，Mc-Culloygh 等［7］证实，该位点 SNP 与女性乳腺癌发生相关，且CC 基因型可显著增加女性乳腺癌患病风险。Goulas 等［8］在对血脂异常患者的研究中观察到该位点TT 基因型与较高的糖化血红蛋白和血浆甘油三酯水平相关，是增加糖化血红蛋白和血浆甘油三酯的危险因素。Ershova 等［9］认为该位点 C 等位基因是氧化应激发展中的危险因素，可导致发生氧化应激的风险增加。而本研究检测到CAT基因rs1001179位点基因型及等位基因频率分布在健康对照组和COPD 组之间的差异有统计学显著性（P＜0.05），风险评估显示，与C 等位基因相比，携带T等位基因的受试者COPD 发病风险较低，提示T等位基因可能为保护性因素。进一步对COPD 的常见并发症PH进行易感性分析，并未观察到该位点在COPD 非PH组和COPD 相关PH 组之间的差异有统计学显著性（P＞0.05）。

CYBA基因位于第16号染色体的长臂上，长度为8.5 kb，包括6 个外显子［2］，rs1049255 位点位于该基因的3'端非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）。Xu 等［10］在对急性心肌梗死的风险以及冠状动脉狭窄程度的研究中阐明rs1049255 位点多态性可能对冠状动脉粥样硬化风险具有保护作用，其G 等位基因可能是该病的保护性因素。Zhou等［11］在对终末期肾脏病的基因多态性研究中阐明该位点与NOXs 活性降低和p22phox蛋白含量降低有关，其中GG 基因型和G 等位基因可能是抵抗终末期肾脏病风险的保护因素，这可能是由于GG基因型与ROS产生减少和氧化应激减弱有关。本研究观察到rs1049255 位点基因型及等位基因频率在中国宁夏地区汉族COPD 相关PH 及COPD 非PH 患者之间的差异有统计学显著性（P＜0.05）；风险评估显示，与GG基因型相比，携带AA基因型的 COPD 患者 PH 发病率较高，与 G 等位基因相比，携带A 等位基因的COPD 患者发生PH 风险较高，GG 基因型及G 等位基因可能为PH 的保护性因素。

表5 健康对照组与COPD组间CAT、CYBA和NIK基因SNP位点基因型及等位基因频率的对比Table 5.Distribution of genotypes and alleles of CAT，CYBA and NIK gene SNP loci in control and COPD groups

NF-κB 是一种核转录因子，通过 NF-κB 介导的信号通路，可以激活核调节的多种炎症因子的表达［12］。该信号通路的关键事件是NIK 的积累，可间接引起炎性因子增加，介导COPD 或COPD 相关PH的发生［13］。本研究检测到NIK基因 rs7222094 位点等位基因频率在COPD 非PH 组与COPD 相关PH 组之间的差异有统计学显著性（P＜0.05），但该位点尚未被广泛研究。Thair等［14］观察到该位点的SNP与感染性休克患者死亡率显著相关，基因型为CC 纯合子的患者死亡率将显著增加。本研究的风险评估显示，与C 等位基因相比，携带T 等位基因的COPD 患者发生PH 的风险将减低，提示C 等位基因可能是风险等位基因，但本研究尚未检测到该位点基因型在组间的差异有统计学显著性（P＞0.05）。此外，rs9932581 和rs7943316 位点在各组间的差异无统计学显著性（P＞0.05），可能与种族、地域差异、检测方法、样本量大小等因素均有关。

综上所述，CAT基因rs1001179 位点T 等位基因可能为COPD 的保护因子，可降低COPD 发病风险；CYBA基因 rs1049255 位点 GG 基因型和 G 等位基因及NIK基因rs7222094 位点T 等位基因可能为COPD相关PH 的保护因子，可降低COPD 相关PH 发病风险。因此对于某些COPD 及其相关PH 高危患者，可进行基因检测，早期预防及干预，这为COPD 及其相关PH基因易感性的个体化预防提供了新线索。

表6 COPD非PH组与COPD相关PH组间CAT、CYBA和NIK基因SNP位点基因型及等位基因频率的对比Table 6.Distribution of genotypes and alleles of CAT，CYBA and NIK gene SNP loci in COPD without PH and COPD with PH groups