尼古丁对多种干细胞中烟碱型乙酰胆碱受体表达的影响*

邱 敏， 李晓红， 黄兹锐， 陈 景， 周成斌， 陈寄梅， 庄 建△

（1华南理工大学医学院，广东广州510641；2广东省人民医院，广东省心血管病研究所，广东省华南结构性心脏病重点实验室，广东广州510080）

吸烟会增加吸烟者罹患各种肿瘤和心血管疾病等的风险，同时孕期烟草或尼古丁的暴露对母体和胎儿的健康均有不良影响［1-2］。吸烟也是导致过早死亡的主要原因。尼古丁作为香烟中的一种关键化合物，除了上瘾外，它还可能导致各种不良的健康问题。大量的研究报道尼古丁对干细胞的增殖、分化、迁移等均有不同程度的影响［3-4］，且其机制与多种烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）有关，尼古丁是这些受体重要的激动剂［5］。而干细胞中本身的以及尼古丁暴露后的nAChRs 的表达差异有待而进一步研究。本研究以4 种干细胞——人胚胎干细胞系H9、人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPSC）、人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）和人骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSC）为研究对象，观察尼古丁处理前后这些细胞上nAChRs 表达情况及变化，为探究尼古丁的作用机制提供理论基础。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞 H9 细胞和IPSC（北京赛贝生物技术有限公司）；BMMSC（赛业生物科技有限公司）；UCMSC来自健康足月剖宫产胎儿脐带（已获得广东省人民医院伦理审批及产妇知情同意）。

1.2 试剂 尼古丁和胰酶（Sigma-Aldrich）；E8 人多潜能干细胞培养基和人多潜能干细胞消化液（含EDTA）均购自北京赛贝生物技术有限公司；DMEM/F12 和澳洲胎牛血清（Gibco）；Matrigel（BD）；青霉素和链霉素（华北制药公司）；RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制剂（Solarbio）；TBST 缓冲液（上海生工生物工程股份有限公司）；逆转录试剂盒（PrimeScript RT Master Mix）和SYBR Premix Ex Taq™ II试剂盒（TaKa-Ra）；琼脂糖、TAE 和 DNA 染液（Thermo Fisher）；PVDF膜（Millipore）；SDS-PAGE预制胶（Genscript）。

1.3 仪器 CO2培养箱（Thermo Forma）；T25 培养瓶和6 孔培养板（无锡耐思生物科技有限公司）；载玻片（Invitrogen）；凝胶电泳仪（北京华圣科仪实验设备有限公司）；Western blot 电泳槽（Bio-Rad）；FACSAria 分光光度计（BD）；酶标仪（南京华东电子集团医疗装备有限责任公司）；SimpliAmp 梯度PCR仪（Thermo Fisher Scientific）；5810R 离心机和5415R冷冻离心机（Eppendorf）；NanoDrop 2000超微量生物检测仪（Gene Company Limited）；ViiA 7 荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）；SP5-FCS激光扫描共聚焦显微镜（Leica）。

2 方法

2.1 细胞培养及尼古丁处理

2.1.1 H9 细胞与IPSC 培养 用复苏培养基复苏后，观察细胞形态并于48 h 后更换E8 培养基，期间用EDTA 进行消化传代，所有使用的培养板和瓶均用低生长因子基质胶包被至少1 h。

2.1.2 UCMSC 分离及培养 用PBS 洗涤剪碎后的健康足月剖宫产胎儿脐带，加入0.2% Ⅱ型胶原酶、青霉素和链霉素消化6 h；过滤并将滤液离心，沉淀重悬，接种到培养皿中。观察细胞贴壁之后，更换培养基，可进行传代培养、冻存等后续操作，取第3～5代进行实验。

2.1.3 BMMSC 培养 使用DMEM/F12 加10%胎牛血清常规培养，期间用0.25%胰酶-EDTA 进行消化传代。

4 种细胞均铺在6 孔板中，培养在37℃、5% CO2温箱中，尼古丁加入相应培养基中配成浓度为1 μmol/L 的尼古丁处理液，待细胞密度待到生长成60%～70%时，处理组更换为尼古丁处理液，培养48 h后收集细胞。以上实验重复3次以上。

2.2 总蛋白提取及Western blot 检测nAChRs 蛋白水平 采用RIPA 裂解缓冲液（并加入PMSF）从细胞中提取总蛋白，用BCA 法进行蛋白定量，取30 μg 蛋白溶解产物进行电泳，然后转到PVDF 膜上，条件为恒压110 V、150 min，之后PVDF 膜用5%的牛奶在TBST缓冲液中低速摇床上封闭1 h，在4℃条件下与I抗（抗nAChRs 各种亚基的抗体）孵育过夜，然后用TBST 洗涤3次，在4℃条件下，孵育相对应的II抗，约45 min，取适量A、B 两种显影试剂，按照1∶1 的比例混合配置成显影液，显影后检测nAChRs蛋白表达情况。以上实验重复3 次以上。所用抗体的详细情况见表1。

2.3 总 RNA 提取及 RT-PCR 检测 nAChRs 的 mRNA水平 细胞接种于6 孔板用PBS 洗3 次之后，每孔加入1 mL TRIzol，冰上裂解5 min，然后收集到EP 管，每管加入氯仿200 mL，震荡后室温静置10 min，随后4℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清于新的EP 管，加入 500 mL 异丙醇，震荡15 s，静置10 min，4℃、12 000 r/min 离心 15 min，弃上清。加入 1 mL 冷 75%乙醇，混合后4℃、7 500 r/min 离心5 min，弃上清，重复2 次，适度晾干，加入适量无酶水溶解，测浓度。根据逆转录试剂盒进行转录得到cDNA。PCR 条件:93℃预变性；93℃ 40 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s 进行 35次循环；72℃保温7 min。引物序列见表2。产物进行琼脂糖凝胶电泳。

表1 Western blot及细胞免疫荧光实验用抗体Table 1.The description of the antibodies used in Western blot（WB）and cellular immunofluorescence（IF）

2.4 细胞免疫荧光检测nAChR 的表达位置 细胞用PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定过夜10 min，0.1%Triton 渗透。载玻片在封闭液中封闭1 h，用抗nAChRs各种亚基的抗体在4℃孵育过夜。PBS洗后，用驴抗兔免疫球蛋白IgG（H+L）孵育载玻片，用DAPI进行核染色。用激光扫描共聚焦显微镜拍照。使用的抗体如表1所示。

2.5 RT-qPCR 检测尼古丁处理前后nAChRs的表达变化 使用TRIzol 试剂提取的并纯化RNA，并使用逆转录酶试剂盒进行逆转录，得到cDNA。根据制造商（TaKaRa）的说明，使用SYBR Premix Ex Taq™ II 主混合试剂盒进行qPCR。引物序列见表2。将被测基因的Ct 值与内参照GADPH 的Ct 值进行归一化，得到各基因的相对表达水平。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析。实验结果以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间均数比较采用t检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

结 果

1 细胞形态

细胞在T25 瓶中培养，细胞形态均一，状态良好。各类型的细胞形态存在明显差异，成体干细胞（BMMSC 和UCMSC）呈梭形，旋涡状生长；H9 细胞和IPSC是圆形，克隆样生长，见图1。

2 nAChRs亚基的mRNA表达水平

RT-PCR 产物经过琼脂凝胶电泳显示，H9 细胞表达α2、α3、α4、α7、α9、β1 和β2；IPSC 表达α3、α4、α7、α9、β1 和β2；BMMSC 表达α2、α3、α7、α9 和β1；UCMSC表达α2、α3、α4、α7、α9、β1和β2，见图2。

表2 PCR相关引物序列Table 2.The sequences of the primers for PCR

Figure 1.The morphological observation of different stem cells（scale bar=400 μm）.H9:human embryonic stem cells；IPSC:induced pluripotent stem cells；BMMSC:bone marrow mesenchymal stem cell；UCMSC:umbilical cord mesenchymal stem cells.图1 各种干细胞的形态观察

3 nAChRs亚基的蛋白表达

Western blot 结果显示，在蛋白水平，2 种胚胎干细胞的nAChRs 亚基表达较一致，H9 细胞和IPSC 中均表达α2、α3、α4、α7、α9和β1；而在成体干细胞中，UCMSC 表达α2、α3、α4、α7、α9 和β1 这6 种nAChRs亚基，类似于多能干细胞，BMMSC 仅表达α4、α7、α9和β1这4种nAChRs亚基，见图3。

4 nAChRs亚基的免疫荧光检测

细胞中受体表达虽有差异，但在4 种细胞中的定位无明显差异，其中α3亚基主要位于细胞核，α4、α9 和β1 亚基位于细胞质中，α2 和α7 亚基位于细胞核和细胞质中，见图4。

5 尼古丁对nAChRs表达的影响

比较尼古丁处理48 h 后细胞中nAChR 的mRNA水平，与对照组相比，H9 细胞的α2 和α9 显著下调（P＜0.01），而α3、α4 和β1 显著上调（P＜0.01）；IPSC中，α2、α3和β2显著上调（P＜0.01）；BMMSC 中，β2显著上调（P＜0.01）；而UCMSC 中，α2 和β2 显著下调（P＜0.01）。见图5。

Figure 2.The mRNA expression of nAChR subunits in various stem cells detected by RT-PCR and showed by agarose gel electrophoresis.H9:human embryonic stem cells；IPSC:induced pluripotent stem cells；BMMSC:bone marrow mesenchymal stem cells；UCMSC:umbilical cord mesenchymal stem cells.M:DNA marker；GAP:GAPDH.图2 RT-PCR 和琼脂糖凝胶电泳检测各种干细胞内nAChRs亚基的mRNA表达

Figure 3.The protein expression of nAChR subunits in various stem cells detected by Western blot.H9:stem human embryonic cells；IPSC:induced pluripotent stem cells；BMMSC:bone marrow mesenchymal stem cells；UCMSC:umbilical cord mesenchymal stem cells.图3 Western blot 检测各种干细胞内nAChRs 亚基的蛋白表达

讨 论

虽然尼古丁的毒理作用被广泛研究，但其致病机制或者对细胞功能的调控机制仍需进一步探索。而胚胎、胚胎样及成体干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞等多种细胞的能力，亦可成为体外多种疾病研究的细胞模型［6］，因此成为临床和科研的关注热点。有研究发现，电子烟成分的气溶胶能对H9 细胞产生毒性［7］，而尼古丁可诱导非人灵长类动物的胚胎干细胞向成纤维细胞转变［8］。还有报道指出，尼古丁抑制间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的再生，MSC 在低浓度尼古丁作用下增殖被抑制，而相对高浓度的尼古丁则促进其增殖［9-10］。这些研究表明，尼古丁等环境因素在干细胞的广泛运用过程中会起一定的影响作用，然而对于干细胞中以尼古丁为激动剂的nAChRs的表达情况目前还鲜有报道。因此，我们研究了干细胞中nAChRs 亚基的表达以及其受尼古丁调控的影响，并试图揭示其规律。

nAChRs 属于配体门控通道受体，由各种不同亚基组成的同源及异源性五聚体构成，在哺乳动物中发现存在 16 个亚基（α1～7、α9～10、β1～4、δ、ε 和γ），其中α1、β1、δ、ε 和 γ 属于肌肉型受体，其余是神经性型受体［11］。本研究发现 H9 细胞、IPSC、UCMSC 和BMMSC 明显表达nAChRs 部分亚基，但情况各不相同。在 mRNA 和蛋白水平上，H9 细胞、IPSC 和UCMSC 均表达 α2、α3、α4、α7、α9 和 β1。IPSC 是认为诱导的具有胚胎干细胞特性的一类细胞，这可能解释了H9细胞与IPSC的受体表达情况相似的原因。而蛋白水平上，BMMSC 仅部分受体亚基表达明显。同时，所有这些受体亚基可能在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥作用。然而，在蛋白水平上，4 种细胞均未检测到β2亚基的表达。β2亚基对nAChRs中乙酰胆碱等结合位点和有效离子通道的形成是不可或缺的［12］，其他亚基与β2 形成结合体已被多项研究报道是尼古丁发挥作用的重要成分。4 种细胞均源自人类，但分化存在差异，与成熟的分化组织距离不同，因此我们的结果提示干细胞的分化潜能越高，表达nAChRs 亚基的种类就越多。细胞免疫荧光检测到同一受体在不同类型细胞上的定位是一致的，但不同受体亚基之间的定位存在差异，可以表达于细胞核，也可以表达于细胞质中，也有的同时位于细胞核和细胞质中，因此我们推测不同nAChRs可能在不同的时间和空间上发挥不同的功能。

尼古丁作为nAChRs的激动剂，对受体的改变可能是影响细胞功能的原因。1 μmol/L 的浓度接近吸烟者血液中尼古丁生理浓度的均值［13］，因此本研究选择1 μmol/L 浓度的尼古丁处理细胞。我们也猜测不同干细胞的nAChRs 被尼古丁影响的情况可能与分化潜能有联系。在尼古丁处理后，本研究亦发现nAChRs 亚基表达发生变化，且在不同细胞中变化不一致，其中分化潜能最高的H9 细胞中多种受体亚基均发生改变，提示H9 细胞对尼古丁的高敏感性，即分化潜能越高，对尼古丁的调控越敏感。另外，尼古丁作用后α2 亚基在H9 细胞中上调，而在IPSC 和UCMSC 中表达下调。α2的研究目前较少，其改变与酒精、吸烟等效应有关，在大量吸烟青少年中表达增加［14］。这些差异可能是不同细胞对尼古丁的敏感性存在差异的原因。α7 作为调节炎症、细胞增殖分化等多种功能的受体亚基［15］，在本研究中未检测到尼古丁对其表达的明显影响。因此，我们发现尼古丁对干细胞中nAChRs 的调控确实存在，但是α7 亚基的稳定性最强，在多种干细胞中均不受生理浓度下的尼古丁调控，这也解释了α7 在多种细胞中发挥重要作用且被广泛报道的原因，但具体机制需进一步探究。

Figure 4.The expression of nAChR subunits in different stem cells was detected by immunofluorescence staining（scale bar=50 μm）.DAPI staining was performed to visualize nuclei（blue），while the nAChR subunits exhibited red or green fluorescence.图4 免疫荧光检测nAchRs亚基在各种干细胞中的表达

Figure 5.The mRNA expression levels of nAChR subunits in various stem cells treated with 1 μmol/L nicotine were detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图5 1 μmol/L的尼古丁处理前后各种干细胞中nAChRs亚基mRNA表达的变化

本研究对多种干细胞中尼古丁受体及尼古丁暴露后受体的变化进行了探究，发现不同干细胞中nAChRs 亚基存在表达差异，表明这些细胞对尼古丁的敏感性也是有差异的，需要进一步研究不同亚基的具体功能及其在疾病发生的作用。同时，考虑到干细胞的分化潜能高低及其所处的时期，结合本研究发现的尼古丁影响干细胞nAChRs 亚基表达的情况，我们推测尼古丁可能在胚胎生长发育早期的影响更大，但需要进一步研究证实。而尼古丁使干细胞发生表观遗传学的改变可能也是重要且值得进一步研究的机制。