Tim-3和Gal-9在人慢性牙周炎牙龈组织巨噬细胞上的表达*

孙 澎， 刘利思， 王 刚， 黄世光

（1暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院口腔医学中心，广东深圳518020；2暨南大学口腔医学院，广东广州510632；3中山大学附属中山医院口腔分院牙体牙髓病科，广东中山528403）

含T 细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白（T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein，Tim）家族是T细胞表面的跨膜蛋白家族。目前发现在人类 Tim 家族中有 3 个蛋白（Tim-1、Tim-3 和Tim-4），其基因定位于染色体5q33.2区域，与变应性鼻炎、超敏反应、哮喘和免疫缺陷密切相关［1-2］。Tim-3 为辅助性T 细胞1（T helper 1 cells，Th1 细胞）表面标志分子，也可表达在调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）、Th17 细胞、内皮细胞、巨噬细胞（macrophages，Mφ）及树突状细胞（dendritic cells，DCs）上，在肿瘤细胞，如胃癌和黑色素瘤细胞上亦有表达［1，3］。半乳糖凝集素 9（galectin-9，Gal-9）是Tim-3的配体之一。研究显示，Tim-3 与Gal-9 结合可对Th1 细胞的免疫功能产生负向调节而导致Th1 细胞死亡，结合体内阻断实验结果提示Tim-3可能是终止Th1 细胞免疫应答的抑制性分子［4］。Mφ 在固有免疫及适应性免疫反应中发挥重要作用，在炎症过程中当病原体侵入宿主后，Mφ 可有效清除病原体。Mφ作为牙周疾病中重要的免疫活性细胞，在免疫应答反应、病损发展、长期炎症等方面有重要地位［5］。研究表明，组织内环境及细胞因子的变化、病程的演变等在不同疾病中均可诱导产生不同类型的Mφ 来介导炎症反应［6］。CD68是分布于细胞表面的相对分子质量为110 kD的跨膜糖蛋白，在单核细胞表面较少，但向Mφ 转化后表达增加，因此CD68 是常用于鉴定Mφ 的表面标志物［7-10］。目前，在人慢性牙周炎组织Mφ 上Tim-3 和Gal-9 的表达情况尚未见报道。本研究采用免疫荧光双染色法，观察人慢性牙周炎牙龈组织标本中CD68-Tim-3 双阳性细胞和CD68-Gal-9双阳性细胞的表达情况，探讨慢性牙周炎牙周组织破坏程度与Tim-3和Gal-9在Mφ上表达的关系。

材 料 和 方 法

1 研究对象

1.1 病例选择 选择2018年8月～2019年4月在暨南大学第二临床医学院口腔医学中心口腔颌面外科和牙周病科就诊的自愿接受本次研究的患者，年龄16～65岁，其中男性43名，年龄（39.0±15.1）岁，女性37名，年龄（34.0±13.9）岁。受试者均无系统性疾病如血液病、糖尿病、类风湿性关节炎等；近3个月未服用激素类药物或抗生素；女性受试者为非妊娠或哺乳期；1年内未接受过牙周手术治疗。慢性牙周炎的纳入标准依据1999 年美国牙周病学会的牙周病新分类［11］。操作符合人体试验委员会制定的伦理学标准并获得批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 分组及取材 （1）健康对照组20 例:牙龈无炎症，无附着丧失（attachment loss，AL），X 线照片显示无牙槽骨吸收，取自因正畸需要拔除的前磨牙或牙周健康的智齿；（2）轻度慢性牙周炎组20例:牙龈有炎症，牙周袋≤4 mm，AL 1～2 mm，X 线照片显示牙槽骨吸收≤根长1/3，取自因需要接受临床牙冠延长术者；（3）中度慢性牙周炎组20 例:牙龈有明显炎症，探诊明显出血，也可有脓，X 线照片显示牙槽骨吸收超过根长的1/3，但不超过根长的1/2，牙齿可出现松动，多根牙可出现根分叉感染，取自需要接受牙周翻瓣术的内斜切口牙龈组织；（4）重度牙周炎组20例:取自牙周翻瓣术中切取、无法保留或预后差的需拔牙的重度牙周炎患者，牙龈有明显炎症，牙周袋＞6 mm，AL≥5 mm，X 线照片显示牙槽骨吸收＞根长1/2，甚至达到根长的2/3，牙齿松动III度［12］。

2 实验方法

2.1 组织标本的采集和处理 按照分组条件采集的各组牙龈组织标本于4%甲醛溶液中固定超过48 h，随后脱水、石蜡包埋，制成5 μm 厚颊舌向牙龈组织连续切片，行HE染色。

2.2 CD68-Tim-3 双阳性细胞和CD68-Gal-9 双阳性细胞免疫荧光双染色 I 抗:CD68 抗体（Abcam），稀释比1∶100；Tim-3 抗体（武汉博士德），稀释比1∶200；Gal-9抗体（武汉博士德），稀释比1∶200。Ⅱ抗:山羊抗小鼠IgG（H+L）Alex Flour®555 和山羊抗兔IgG（H+L）Alex Flour®488（Cell Signaling Technology），稀释比1∶200。组织切片经脱蜡、复水，在修复盒经微波炉加热修复抗原；遮光条件下采用牛血清白蛋白孵育、Ⅰ抗孵育、Ⅱ抗孵育，封片并立即在荧光显微镜下观察拍照。DAPI 核染为蓝色荧光，Tim-3 阳性和Gal-9 阳性信号为红色荧光，CD68 阳性信号显现为绿色荧光，定位于细胞膜或细胞浆，红光和绿光在显微镜同一视野下重叠后为橘黄色荧光。由2 名病理医师观察免疫荧光双染色切片中CD68-Tim-3和CD68-Gal-9双阳性细胞的个数，并通过测量组织面积以获得每mm2的细胞个数，再取其平均值。

3 统计学处理

对取得的计量数据以均数±标准差（mean±SD）表示，采用统计软件SPSS 13.0 分析处理。CD68-Tim-3 和CD68-Gal-9 双阳性细胞平均密度的比较采用单因素方差分析。采用Levene法进行方差齐性检验，若方差齐时，两两比较选用Bonferroni 法，方差不齐时选用Tamhane's T2 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 组织学观察结果

HE 染色结果显示，健康对照组结缔组织中未见明显炎症细胞浸润，见图1A；轻度慢性牙周炎组可见淋巴细胞及浆细胞少量散在分布，见图1B；中度慢性牙周炎组可见较多的慢性炎症细胞（如淋巴细胞、中性粒细胞等）浸润，呈局灶状，见图1C；重度慢性牙周炎组可见固有层中大量炎症细胞（如浆细胞、淋巴细胞、肥大细胞等）聚集，见图1D。

Figure 1.HE staining of human gingival tissues（scale bar=50 μm）.A:healthy control group；B:slight chronic periodontitis group；C:moderate chronic periodontitis group；D:severe chronic periodontitis group.图1 各组牙龈组织HE染色结果

2 CD68-Tim-3双阳性细胞双染色结果

免疫荧光染色结果显示，各组牙龈组织中Mφ均表达Tim-3。健康对照组牙龈组织中只观察到极少量的CD68-Tim-3 双阳性细胞；轻度慢性牙周炎组CD68-Tim-3 双阳性细胞呈散在分布，且密度较健康对照组显著增加；中度慢性牙周炎组CD68-Tim-3 双阳性细胞显著增加；重度牙周炎组牙龈组织中可见大量CD68-Tim-3 双阳性细胞；各组牙龈组织标本的阴性对照未见荧光表达。统计CD68-Tim-3 双阳性细胞的密度，结果显示，慢性牙周炎组CD68-Tim-3双阳性细胞密度均比健康对照组高（P＜0.01）；中度慢性牙周炎组CD68-Tim-3 双阳性细胞密度较轻度慢性牙周炎组显著升高（P＜0.01）；重度慢性牙周炎组CD68-Tim-3 双阳性细胞密度较轻、中度慢性牙周炎组显著升高（P＜0.01）。见图2。

3 CD68-Gal-9双阳性细胞双染色结果

免疫荧光染色结果显示，各组牙龈组织中Mφ均表达Gal-9。健康对照组牙龈组织中只观察到极少量的CD68-Gal-9 双阳性细胞；轻度慢性牙周炎组CD68-Gal-9 双阳性细胞呈散在分布，且密度较健康对照组显著增加；中度慢性牙周炎组CD68-Gal-9 双阳性细胞显著增加；重度牙周炎组牙龈组织中可见大量CD68-Gal-9 双阳性细胞；各组牙龈组织标本的阴性对照未见荧光表达。统计CD68-Gal-9双阳性细胞的密度，结果显示，CD68-Gal-9双阳性细胞密度在慢性牙周炎组均比健康对照组高（P＜0.01），在中度慢性牙周炎组较轻度慢性牙周炎组显著升高（P＜0.01），在重度慢性牙周炎组较轻、中度慢性牙周炎组显著升高（P＜0.01）。见图3。

讨 论

牙周炎是牙齿支持组织的慢性感染性疾病，菌斑微生物通过介导免疫细胞分泌细胞因子引发的宿主免疫反应决定牙周炎的进展［13］。Mφ 作为宿主免疫反应的重要组成部分，在组织损伤或病原菌侵入时，可通过其表面的Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）识别清除病原菌并分泌多种细胞因子调节机体免疫反应，激活适应性免疫应答，在免疫反应中起主要作用［14］。大量研究表明，Mφ 参与牙周炎的发生发展。Mφ 作为牙周组织对抗牙周致病菌的第1道防线，通过吞噬作用清除病原体而减轻炎症，但是其过度活化可破坏牙周组织，加重牙周炎的进程。有研究显示，牙周组织中的Mφ 主要为M1 型Mφ，同时可观察到少量M2 型Mφ，龈沟液中可检测到大量促炎因子和骨吸收因子，故M1 型Mφ 在牙周炎的发生发展中起主要作用［］。CD68 是Mφ 谱系中高度特异性表达的蛋白质，可作为Mφ 的标志物［7-10］。本实验对慢性牙周炎患者的牙龈组织标本进行免疫荧光染色观察到，与健康对照组相比，慢性牙周炎牙龈组织中有大量CD68+细胞浸润，且CD68+阳性细胞的数量随着牙周炎病变程度的加重而显著上升，与Golijanin 等［17］的结果一致，表明 Mφ 谱系的 CD68+细胞参与牙周炎的进程。

Tim-3 作为Tim 超家族的一个成员，近年来被发现是一种免疫调控分子。Tim-3 被证实在免疫应答反应中起抑制性调节作用，与程序细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）作用类似，主要促进T 淋巴细胞发生凋亡并诱导免疫耐受的发生［18］。Gal-9 是半乳糖结合蛋白家族的成员，N 端和C 端两个CRD 区域共同组成了Gal-9 的结构，主要决定T 淋巴细胞的受体识别及死亡信号的启动［19］。目前，许多研究者认为Gal-9 是一种能影响多种免疫细胞的多效性调节分子［20］。Gal-9 是 Tim-3 的配体，在结构上是一种独特的“串联重复序列”。研究发现Tim-3-Gal-9信号通路在免疫逃逸机制中发挥关键作用［4］。Tim-3 和 Gal-9 结合可诱导 CD4+、CD8+T 细胞凋亡，阻断Tim-3/Gal-9 可增加效应和记忆性CD8+T细胞的数量。CD8+T 细胞受抗原刺激后主要分化为Th1 和 Th2 细胞［4］。研究显示，介导细胞免疫的 Th1和介导体液免疫的Th2 间的平衡与慢性牙周炎的间歇性和进展性有关［21］。慢性牙周炎早期阶段，在多形核中性粒细胞和Mφ 分泌的IL-12 的介导下，激发机体固有免疫功能，导致Th1 免疫应答，Th1 细胞所产生的干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）参与Mφ 活化，产生M1型Mφ，诱导炎症因子（如IL-1β、IL-2及IL-6）的产生，促进炎症细胞聚集和破骨细胞形成，加重炎症反应和牙槽骨的破坏，同时上调Gal-9 的表达产生负反馈调节，导致Tim-3+Th1 细胞发生凋亡［22-23］。当牙周炎进行性破坏发展到晚期，Th2 细胞介导的体液免疫应答占主导地位，IL-4和IL-13等可参与调节B 细胞的免疫炎症反应并极化Mφ 为M2 型Mφ，通过产生IL-10、转化生长因子β 等抗炎型细胞因子抑制炎症反应，在炎症后期阶段促进局部组织修复和再生，调节机体免疫平衡［15］。研究显示，Th1 细胞的Tim-3表达与IFN-γ呈负相关，而Th2细胞的Tim-3与IL-4无关，提示Tim-3可能参与Th1/Th2平衡改变，下调Th1 免疫应答可能影响Th1/Th2 免疫应答平衡，促使免疫逃逸［21］。同时，有研究报道，病原感染而诱导Mφ 表达Tim-3 上调，可能参与该类细胞的激活及细胞因子分泌［24］。此外，Tim-3 可抑制致病性促炎M1型Mφ 的极化，而下调或阻断Tim-3 可致M1 反应增加并增强炎症反应，因此Tim-3 过表达可降低M1 型Mφ 的反应以减弱炎症［24-26］。de Oliveira 等［27］在根尖周疾病的研究观察到，Tim-3/Gal-9 可能介导Mφ 极化，Tim-3 可抑制致病性促炎M1 型Mφ 极化，而下调或者阻断Tim-3 可致M1 反应增加，增强炎症反应。这些结果均提示Tim-3 和Gal-9 可通过调节Mφ 的作用而参与炎症反应。

Figure 2.Densities of CD68-Tim-3 double positive cells in gingival tissues（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=20. *P＜0.01 vs healthy control group；#P＜0.01 vs slight chronic periodontitis group；△P＜0.01 vs moderate chronic periodontitis group.图2 各组牙龈组织CD68-Tim-3双阳性细胞比较

Figure 3.Densities of CD68-Gal-9 double positive cells in gingival tissues（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=20. *P＜0.01 vs healthy control group；#P＜0.01 vs slight chronic periodontitis group；△P＜0.01 vs moderate chronic periodontitis group.图3 各组牙龈组织CD68-Gal-9双阳性细胞比较

目前，Tim-3 及其配体Gal-9 在人慢性牙周炎牙龈组织Mφ 上的表达情况尚未清楚。本研究通过免疫荧光双染色，首次证实了在人慢性牙周炎牙龈组织的Mφ 可表达Gal-9 和Tim-3。同时，结果显示CD68-Tim-3双阳性细胞和CD68-Gal-9双阳性细胞数量随牙周炎病变程度加重而增多，提示Gal-9 和Tim-3阳性细胞可能参与慢性牙周炎的病程发展。Tim-3可通过与其配体Gal-9结合识别Mφ并调节其吞噬作用。结合Tim-3-Gal-9信号通路在免疫逃逸机制中的研究，我们的结果提示 Gal-9 和 Tim-3 阳性 Mφ 对慢性牙周炎可能具有促进作用，但Gal-9 和Tim-3 阳性Mφ 如何参与慢性牙周炎的免疫调控机制尚不清楚，有待进一步研究。