白细胞分化抗原36的棕榈酰化位点突变对HepG2细胞自噬的影响*

俞 婷， 夏 珺， 赵 蕾

（重庆医科大学脂糖代谢性疾病重庆市重点实验室，重庆400016）

自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是一种正常的生理现象［1］。自噬参与了各种疾病的发生发展，包括肿瘤、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等［2-3］。

白细胞分化抗原36（cluster of differentiation 36，CD36）是一种模式识别受体，能识别多种内源性和外源性有害物质，与多种疾病的发生发展密切相关［4］。既往研究表明，在肝细胞中过表达CD36 可以抑制自噬，下调CD36 的表达则可激活自噬［5］。我们课题组近期研究表明CD36 棕榈酰化修饰与其功能密切相关，CD36 棕榈酰化修饰能够改变其在细胞膜上的定位，增加细胞对游离脂肪酸的摄取，抑制脂肪酸β 氧化，导致细胞内脂质积聚和炎症，而CD36 棕榈酰化位点突变能减少CD36在细胞膜上的定位，降低细胞对脂肪酸的摄取，改善细胞内脂质积聚和炎症［6］。然而，目前尚不清楚CD36 棕榈酰化修饰在自噬中的作用。因此本研究拟通过构建CD36 棕榈酰化位点突变的HepG2细胞，探讨CD36棕榈酰化位点突变对HepG2细胞自噬的影响及其分子机制。

材 料 和 方 法

1 细胞

参照本实验室已发表文献［6］，构建过表达野生型CD36（WT-CD36）和棕榈酰化位点突变型CD36（AA-SS）的HepG2细胞。用PCI-CD36作为模板和突变引物，用多点定向诱变试剂盒（Quick Change ⅡXL，Agilent Technologies）生成 CD36 突变体。慢病毒构建体由上海基因化学公司提供，包括GV341 空载体（阴性对照，negative control，NC）、含WT-CD36的 GV341 载体（WT-CD36）及含 AA-SS 的 GV341 载体。按MOI=10来感染HepG2细胞，并用Sangon提供的嘌呤霉素筛选细胞，分别命名为NC-HepG2、WTCD36-HepG2和AA-SS-HepG2。

2 主要试剂

棕榈酸（palmitate acid，PA）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购于Sigma；GFP-mRFP标记的微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）双荧光腺病毒购于上海吉凯基因化学技术有限公司；BCA 蛋白定量检测试剂盒和兔抗人β-actin 多克隆抗体购于北京鼎国公司；兔抗人转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）多克隆抗体购自于Proteintech；兔抗人FAT/CD36 和鼠抗人FAT/CD36 单克隆抗体购于Novus；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG 抗购于北京中杉金桥公司；TRIT 荧光Ⅱ抗购于北京中杉金桥公司；PVDF 膜和磁珠购于Millipore；ECL 化学发光试剂购于Bio-Rad；羟胺（hydroxylamine，HAM）购于Sigma。

3 主要方法

3.1 细胞培养 细胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM 高糖培养液培养，置于37℃、5%CO2培养箱中。

3.2 荧光共聚焦显微镜检测自噬小体和自噬-溶酶体以及TFEB核转位 将WT-CD36-HepG2和AA-SSHepG2 细胞分别种到共聚焦皿中，待细胞完全贴壁后，加入 LC3 双荧光腺病毒（1∶20 000），72 h 后，0.2% BSA 饥饿处理 12 h，0.2 mmol/L PA 处理24 h，通过共聚焦显微镜观察荧光情况，反映细胞自噬状态（红色荧光增强，同时绿色荧光增强，表明自噬小体形成增加，自噬-溶酶体形成减少；红色荧光增强伴绿色荧光减弱，表明自噬小体形成增加，自噬-溶酶体形成增加）。另将WT-CD36/AA-SS-HepG2 细胞种到共聚焦皿，0.2% BSA 饥饿处理12 h，0.2 mmol/L PA 处理 24 h，冰甲醇固定细胞，3% BSA 封闭，TFEB 抗体（1∶50）4℃孵育过夜，荧光Ⅱ抗室温孵育30 min，DAPI 染色5 min，共聚焦显微镜下观察TFEB的核转位情况。

3.3 免疫共沉淀-酰基-生物素置换实验（IPABE） 用含有蛋白酶抑制剂和N-乙基马来酰亚胺的裂解缓冲液提取总蛋白质。用抗CD36 抗体和磁珠沉淀CD36 蛋白后，将样品用缓冲液重悬。在pH 7.2 缓冲液稀释的样品中加入羟胺（+HAM）或加入羟胺缓冲液（-HAM），室温旋转混匀50 min。加入生物素BMCC 缓冲液，4℃旋转混匀50 min，然后用样品缓冲液煮沸来洗脱磁珠上的蛋白质，通过SDSPAGE 分离上清液，并将其电转至PVDF 膜。检测棕榈酰化的CD36 时，将膜与HRP 偶联的链霉亲和素（streptavidin，Strep）在37℃下孵育1 h；检测总CD36时，将膜与抗CD36抗体4℃孵育过夜，随后用HRP偶联的Ⅱ抗室温孵育1 h。

3.4 Western blot 检测蛋白表达 用试剂盒提取蛋白质，用BCA 试剂盒检测并标化蛋白，SDS-PAGE 分离蛋白，PVDF膜转膜后用3%BSA于37℃封闭1 h，I抗4℃孵育过夜，HRP 标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST 洗膜，ECL 试剂显影。通过ImageJ 软件分析条带。

3.5 免疫共沉淀检测CD36/Fyn 共聚体的形成 将裂解好的蛋白与抗体孵育（4℃）过夜，然后添加蛋白A/G 磁珠，4℃旋转混匀1～3 h。在SDS 样品缓冲液中煮沸5 min，洗脱结合的蛋白质，并通过SDS-PAGE 分离上清液，PVDF 膜转膜后用3% BSA 于37℃封闭1 h，I 抗4℃孵育过夜，HRP 标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，使用ECL试剂进行检测。通过ImageJ分析条带。

4 统计学处理

所有数据均采用GraphPad Prism 软件进行统计分析。所得到的数值均以均数±标准误（mean±SEM）表示。两组间均数比较采用两独立样本t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 构建过表达野生型/棕榈酰化位点突变型CD36的HepG2细胞

Western blot 检测结果显示，与NC 组相比，WTCD36 和 AA-SS 组 CD36 蛋白的表达均显著增加（P＜0.01），见图1A；IP-ABE 检测到在 WT 组中 CD36 蛋白发生了棕榈酰化修饰，而在AA-SS 组中CD36 未发生棕榈酰化修饰（P＜0.01），表明模型构建成功，见图1B。

Figure 1.Identification of HepG2 cells overexpressing wild-type CD36（WT-CD36）/mutated CD36 at palmitoylation sites（AA-SS）.A:the protein expression of CD36 in NC，WT-CD36 and AA-SS cell lines；B:palmylation modification in WT-CD36 and AA-SS cell lines.HAM:hydroxylamine；Strep:streptavidin.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs WTCD36-HAM group；△△P＜0.01 vs WT-CD36+HAM group.图1 HepG2细胞中过表达野生型CD36/棕榈酰化位点突变型CD36细胞的鉴定

2 HepG2 细胞中CD36 的棕榈酰化位点突变可以增强自噬

与WT-CD36 组细胞比，AA-SS 组细胞红色荧光显著增强，绿色荧光显著减弱（P＜0.01），自噬小体增加，且自噬-溶酶体也增加，自噬-溶酶体流增强，见图2。

3 HepG2 细胞中CD36 的棕榈酰化位点突变可以促进TFEB核转位

AA-SS 组细胞中红色荧光（TFEB）较WT-CD36组明显增强，且红色荧光与细胞核的共定位也明显增强，即TFEB核转位显著增加（P＜0.05），见图3。

4 CD36 的棕榈酰化位点突变对LKB1/AMPK 途径的影响

Western blot 结果显示，与WT-CD36 组相比，AA-SS 组p-LKB1/LKB1 比值显著降低（P＜0.01），p-AMPK/AMPK比值显著升高（P＜0.01），见图4。

5 CD36 的棕榈酰化位点突变使CD36/Fyn 的蛋白共聚体减少

免疫共沉淀的结果表明，与WT-CD36 组相比，AA-SS 组的CD36/Fyn 共聚体形成显著减少（P＜0.01），见图5。

Figure 2.Effect of palmitoylation site mutation of CD36 on the autophagy of HepG2 cells.A:autophagy in WT-CD36/AA-SS-HepG2 cells was detected by dual fluorescent adenovirus（scale bar=10 μm）；B，C:the Pearson correlation coefficient and correlation rate.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs WT-CD36 group.图2 CD36蛋白棕榈酰化位点突变对HepG2细胞自噬的影响

Figure 3.Effect of palmitoylation site mutation of CD36 on TFEB nuclear translocation in HepG2 cells.Scale bar=10 μm.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs WT-CD36 group.图3 CD36蛋白棕榈酰化位点突变对HepG2细胞中TFEB核转位的影响

Figure 4.Effect of CD36 palmitoylation site mutation on LKB1/AMPK pathway in HepG2 cells.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs WTCD36 group.图4 CD36蛋白棕榈酰化位点突变对HepG2细胞中LKB1/AMPK通路的影响

讨 论

自噬与NAFLD 的发生发展密切相关，自噬不仅影响肝细胞中脂质的降解，还参与肝细胞损伤和肝脏炎症的发生和发展［3］。本研究构建了WT-CD36-HepG2 和 AA-SS-HepG2 细胞，LC3 双荧光腺病毒结果显示，与WT-CD36 组相比，AA-SS 组自噬小体增加，且自噬-溶酶体也增加，表明CD36 棕榈酰化位点缺失会增强HepG2细胞的自噬-溶酶体流。

TFEB属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族，TFEB 的核转位是启动溶酶体生物发生和调控自噬-溶酶体流的关键因素［7］。TFEB 的核转位受到磷酸化修饰的严密调控。当TFEB 发生去磷酸化时，其进入细胞核内，与核内自噬相关基因结合，启动自噬；而磷酸化的TFEB 则滞留在细胞质内，不能与核内自噬相关基因结合，从而使自噬处于较低水平［7］。生物能量代谢调节的关键分子AMPK 可以通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），抑制 TFEB 的磷酸化，增加TFEB 核转位［8］。本研究结果显示，AA-SS 组 AMPK的磷酸化水平比WT-CD36 组明显增加，TFEB 在细胞核的定位也显著增加，表明了CD36棕榈酰化位点突变可能通过激活AMPK 通路，促进TFEB 的核转位。

Figure 5.Effect of CD36 palmitoylation site mutation on formation of CD36/Fyn complex in HepG2 cells.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs WT-CD36 group.图5 CD36 棕榈酰化位点突变对HepG2 细胞中CD36/Fyn蛋白共聚体形成的影响

研究表明，CD36 能与 Fyn 形成共聚体［6］，促进LKB1 的磷酸化，促使LKB1 进入细胞核，抑制AMPK磷酸化［9-10］。在本研究中，我们探讨了CD36 棕榈酰化位点突变激活AMPK 的可能机制。与WT-CD36-HepG2 细胞相比，AA-SS-HepG2 细胞 CD36/Fyn 蛋白共聚体显著减少，p-LKB1/LKB1 的明显降低，表明CD36 棕榈酰化位点突变可能通过抑制LKB1 的磷酸化促进AMPK的活化。

综上所述，CD36的棕榈酰化位点突变可通过减少CD36/Fyn 蛋白共聚体的产生，抑制LKB1 的磷酸化，从而激活AMPK，促进TFEB 核转位，最终引起HepG2细胞自噬增加。