丹参酮ⅡA对ApoE-/-小鼠肝脏脂质沉积及铁死亡相关蛋白表达的影响*

吴 瑶， 宋 囡， 贾连群， 王 杰， 陈 丝， 曹慧敏

（辽宁中医药大学中医药创新工程技术中心，辽宁沈阳110847）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病前期的主要病理基础，其基本病理改变皆因脂质代谢障碍或转运异常所引起。脂质代谢异常造成的脂类物质沉积于肝细胞内是导致AS 发生的重要危险因素之一，同时肝脏生产了各种炎症因子来调控全身的炎症反应，而AS 的发生与发展过程又与很多炎细胞及炎症因子参与密切相关。因此，肝脏是AS 及其相关疾病启动和发展中最易受损的器官之一，肝细胞内脂质沉积以及胆固等流出障碍等亦成为AS 形成与发展的重要因素。研究发现，铁死亡（ferroptosis）是一种区别于细胞凋亡、自噬及焦亡的全新细胞死亡方式，其主要特点是铁离子大量沉积而致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）大量产生，氧化应激激活状态下的脂质过氧化反应致使细胞大量死亡［1］。目前，铁死亡在缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、肿瘤、神经系统疾病等疾病中均发挥重要作用［2］。

丹参酮ⅡA（tanshinone ⅡA）来源于我国的传统中药丹参，具有抑制炎症反应、抗动脉粥样硬化、降低氧化应激损伤、减少肝脏脂质沉积等作用［3-5］。本课题组前期研究发现，丹参酮ⅡA 通过降低ROS 和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的产生、增强总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性来减轻氧化应激，从而抑制肝细胞凋亡，减轻肝脏脂肪变性［6］。那么丹参酮ⅡA 抑制肝脏脂质过氧化的产生且保护肝脏细胞免受ROS损伤的作用有可能是通过拮抗肝细胞发生铁死亡实现的。因此，本研究以载脂蛋白E 基因敲除（apolipoprotein E gene knockout，ApoE-/-）小鼠为 AS 动物模型，以细胞铁死亡为切入点，探讨丹参酮ⅡA 对ApoE-/-小鼠肝脏脂质沉积的影响及作用机制，为中医药的临床应用提供科学实验依据。

材 料 和 方 法

1 动物

实验所用ApoE-/-小鼠和C57BL/6J品系小鼠均为雄性，8周龄，体质量（20±2）g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2012-0001。动物饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，SPF 级，自由饮食饮水，环境温度为（22±1）℃，湿度50%±5%。

2 主要药品、试剂及仪器

丹参酮ⅡA 购自上海源叶生物科技有限公司（货号S31459，纯度≥95%）；辛伐他汀（浙江海正药业股份有限公司）。总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDLC）测定试剂盒（上海科华生物技术有限公司）；还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；ROS 检测试剂盒、I抗稀释液和HE 染色液购自碧云天生物科技有限公司；抗铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1，FTH1）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、p53 和 xCT/SLC7A11 抗 体 购 于 ABclonal Technology。Tanon 5200 化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）；7180 型全自动生化分析仪（Hitachi High-Tech）；BOND-MAX 全自动免疫组化染色机（Leica Biosystems）。

3 主要方法

3.1 模型制备、分组及干预 将32 只ApoE-/-小鼠随机分为 4 组:模型（model）组、丹参酮ⅡA 高剂量（high-dose tanshinone ⅡA）组、丹参酮ⅡA 低剂量（low-dose tanshinone ⅡA）组及辛伐他汀（simastatin）组，每组8只。8只C57BL/6J小鼠作为正常对照（normal control）组。正常对照组每日给予基础饲料。动脉粥样硬化模型制备采用ApoE-/-小鼠给予高脂饲料喂饲，每日给予高脂饲料（含0.15%胆固醇和21%脂肪）喂饲8 周。造模8 周后灌胃给药，给药剂量按人与动物体表面积折算系数进行换算，丹参酮ⅡA高剂量组、丹参酮ⅡA 低剂量组及辛伐他汀组分别采用60 mg·kg-1·d-1丹参酮ⅡA、30 mg·kg-1·d-1丹参酮ⅡA 和 2.275 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃 4 周，正常对照组与模型组给予等体积生理盐水灌胃4周。

3.2 血脂检测 小鼠取材前12 h 内禁食不禁水，取材当天称重，10%水合氯醛麻醉，摘除眼球取血，室温静置后，3 500 r/min 离心25 min，-20℃保存待用。全自动生化分析仪检测小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。

3.3 HE 染色观察肝组织的病理形态 将小鼠肝组织固定于4%多聚甲醛72 h，按HE 染色常规方法进行，70%～100%梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（切片厚度5 μm）、贴片及烤片后，二甲苯脱蜡，70%～100%梯度乙醇复水，苏木精染色，70%盐酸乙醇分色，伊红复染，再用70%～100%梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，石蜡包埋，光学显微镜下观察肝组织形态。

3.4 油红O 染色观察肝脏脂质沉积 取各组肝脏依次放入15%和30%蔗糖中脱水，包埋做成冰冻切片，油红O 染色10 min，75%乙醇分化2 s，苏木素复染2 min，流水冲洗返蓝，甘油明胶封片。

3.5 各组小鼠肝组织ROS 和GSH 含量的检测 取0.1 g 的小鼠肝组织研磨成组织匀浆液，用预冷PBS将其50 倍稀释待用。将100 μL 的待测样品稀释液与0.2 μmol/L 的DCFH-DA 荧光染料等体积混合均匀后，37℃恒温箱避光孵育15 min。用酶标仪在激发波长499 nm 和发射波长525 nm 下检测吸光度（A）。分光光度法检测肝组织中GSH表达。上述检测均按试剂盒说明书操作。

3.6 全自动免疫组化一体机检测小鼠肝脏p53 和GPX4 蛋白的表达 将小鼠肝脏进行石蜡包埋后，以5μm 厚连续切片5 张并标记序号，全自动免疫组化机中将切片分别进行p53 和GPX4 免疫组织化学染色，将染色后的标本进行脱水、封片，在光学显微镜下观察并采集图像，各组标本图像运用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算平均吸光度。

3.7 Wes 全自动蛋白质印迹定量分析系统检测GPX4、xCT、p53及FTH1蛋白的表达 不同样品上样量均为4.5 μL（包括5× Master Mix 0.9 μL，待检样品与0.1× Sample Buffer合为3.6 μL），95℃、5 min变性。样品制备完全，按照样品、封闭液、I 抗、II 抗、发光液及清洗缓冲液的顺序分别加入板内，机器自检后分别放入毛细管芯及板子，设计板子布局，开始检测，150 min完成检测，进行结果分析。

3.8 RT-qPCR 法检测肝组织相关mRNA 的表达水平 取20 mg 肝组织，采用离心柱法提取总RNA，严格按照试剂盒说明书进行操作，测定浓度，将样本总RNA浓度稀释为200 mg/L后反转录为cDNA，加入扩增反应体系运用RT-qPCR 法扩增，40 个循环结束后采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析，检测基因mRNA 相对表达水平。引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，序列见表1。

表1 RT-qPCR相关引物的序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

4 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。实验数据均为计量资料，用均数±标准差（mean±SD）表示。多组之间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠血脂水平比较

与正常对照组相比，模型组小鼠血清中TG、TC和LDL-C 水平显著升高（P＜0.01），HDL-C 水平无显著变化；与模型组相比，辛伐他汀组、丹参酮ⅡA 低剂量组及丹参酮ⅡA 高剂量组小鼠血清中TG、TC 和LDL-C水平显著降低，并且丹参酮ⅡA高剂量组和辛伐他汀组效果优于丹参酮ⅡA 低剂量组（P＜0.05 或P＜0.01），各组间HDL-C 水平的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表2。

表2 各组小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C含量的比较Table 2.Comparison of the serum lipid levels in the mice from each group（mmol/L.Mean±SD. n=8）

2 各组小鼠肝脏病理学变化

正常对照组肝小叶结构正常，肝细胞为圆形，细胞核居中，胞浆内未见脂滴，排列方式为条索状且肝窦不狭窄；模型组肝细胞体积变大，胞浆内可见大量的脂肪空泡，且大小不等，肝窦狭窄或消失；辛伐他汀组脂滴明显减少，其病理改变较模型组明显减轻，可见到正常的肝细胞，肝窦狭窄程度有所减轻；丹参酮ⅡA 高剂量组恢复程度与辛伐他汀组类似，肝细胞脂肪变性程度减轻，脂肪空泡明显减少，肝窦狭窄有所减轻；丹参酮ⅡA 低剂量组较模型组相比，病理改变有所减轻，肝细胞形态变小，胞浆内脂滴减少，但其治疗效果不如辛伐他汀组和丹参酮ⅡA 高剂量组，见图1。

Figure 1.Morphological characteristics of liver tissues in all groups（HE staining，×400）.A:normal control group；B:model group；C:simvastatin group；D:low-dose tanshinoneⅡA group；E:high-dose tanshinone ⅡA group.图1 HE染色观察各组肝组织的形态学特点

3 油红O染色结果

正常对照组小鼠肝脏细胞排列规整，肝细胞内未见橘红色脂滴，细胞核为蓝色，肝窦结构正常；模型组小鼠肝脏细胞肿胀明显，肝细胞间隙变宽，视野出现弥漫性橘红色脂滴，细胞核大小不等，脂质蓄积程度明显加重；辛伐他汀组和丹参酮ⅡA 高剂量组肝脏细胞内橘红色脂滴显著减少，细胞核明显变小，肝窦结构有所恢复或恢复正常，脂质蓄积程度显著减轻；丹参酮ⅡA 低剂量组肝脏细胞内橘红色脂滴有所减轻，但相邻肝细胞内脂滴有融合现象，脂质蓄积减轻效果不如辛伐他汀组和丹参酮ⅡA 高剂量组，见图2。

Figure 2.Oil red O staining of liver tissues in all groups（×400）.A:normal control group；B:model group；C:simvastatin group；D:low-dose tanshinone ⅡA group；E:high-dose tanshinone ⅡA group.图2 油红O染色观察各组肝组织脂质沉积情况

4 各组小鼠肝组织ROS和GSH含量的比较

与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织ROS 含量显著增高（P＜0.01），GSH 含量显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，辛伐他汀组、丹参酮ⅡA 低剂量组及丹参酮ⅡA 高剂量组小鼠肝组织ROS 含量显著降低（P＜0.01），GSH 含量显著升高（P＜0.01）；丹参酮ⅡA 高剂量组的作用效果较丹参酮ⅡA 低剂量组更显著（P＜0.01），见表3。

表3 各组小鼠肝组织ROS和GSH含量的变化Table 3.The contents of ROS and GSH in the liver tissues of mice in all group（Mean±SD. n=3）

5 免疫组化结果

与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织p53 蛋白阳性表达呈现棕黄色颗粒状，染色较深，数量较多，排列密集，肝细胞核被染成蓝色，统计结果表明p53 蛋白阳性表达显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，辛伐他汀组及丹参酮ⅡA 高、低剂量组小鼠肝组织棕黄色较淡，密度下降，排列稀疏，p53蛋白阳性表达显著下降（P＜0.01）；丹参酮ⅡA 高剂量组治疗效果优于丹参酮ⅡA低剂量组（P＜0.01），见图3。

Figure 3.p53 expression in the liver tissues of mice in each group（×400）.A:normal control group；B:model group；C:simvastatin group；D:low-dose tanshinone ⅡA group；E:high-dose tanshinone ⅡA group.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs normal control group；▲▲P＜0.01 vs model group；△△P＜0.01 vs low-dose tanshinone ⅡA group.图3 各组小鼠肝组织中p53的表达情况

正常对照组中GPX4 蛋白阳性免疫产物呈现棕黄色颗粒状或点状标记，数量较多，染色较深，排列密集，细胞核被染成蓝色；与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织GPX4 蛋白阳性表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，辛伐他汀组及丹参酮ⅡA 高、低剂量组小鼠肝组织GPX4 蛋白阳性表达显著上升（P＜0.01）；丹参酮ⅡA 高剂量组治疗效果优于丹参酮ⅡA低剂量组（P＜0.01），见图4。

6 Wes全自动蛋白质印迹定量分析结果

与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织GPX4、xCT 及FTH1 蛋白表达均呈现下降趋势，p53 蛋白表达呈上升趋势（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组相比，辛伐他汀组、丹参酮ⅡA低剂量组和丹参酮ⅡA高剂量组肝组织GPX4、xCT 及FTH1 蛋白表达均呈现上升趋势，p53 蛋白表达呈下降趋势，其中辛伐他汀组促进GPX4、xCT 和FTH1蛋白表达及降低p53蛋白表达的效果均优于丹参酮ⅡA 低剂量组（P＜0.01），丹参酮ⅡA高剂量组促进FTH1蛋白表达及降低p53蛋白表达的效果亦优于丹参酮ⅡA 低剂量组（P＜0.01），见图5。

Figure 4.GPX4 expression in liver tissues of mice in each group（×400）.A:normal control group；B:model group；C:simvastatin group；D:low-dose tanshinone ⅡA group；E:high-dose tanshinone ⅡA group.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs normal control group；▲▲P＜0.01 vs model group；△△P＜0.01 vs low-dose tanshinone ⅡA group.图4 各组小鼠肝组织中GPX4的表达情况

Figure 5.The protein levels of GPX4，xCT，p53 and FTH1 in liver tissues of the mice in each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs low-dose tanshinone ⅡA group.图5 各组小鼠肝组织GPX4、xCT、p53及FTH1蛋白水平

7 RT-qPCR 检测 GPX4、SLC7A11、p53 及 FTH1的mRNA表达

与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织GPX4、SLC7A11 和 FTH1 的 mRNA表达显著下降（P＜0.01），p53 的mRNA 表达显著上升（P＜0.01）；与模型组相比，辛伐他汀组及丹参酮ⅡA 高、低剂量组小鼠肝组织 GPX4、SLC7A11 和 FTH1 的 mRNA 表达显著上升（P＜0.01，P＜0.05），p53的mRNA 表达显著下降（P＜0.01），且丹参酮ⅡA 高剂量组的效果高于丹参酮ⅡA低剂量组（P＜0.05），见表4。

表4 丹参酮ⅡA对小鼠肝脏GPX4、SLC7A11、p53和FTH1 mRNA表达水平Table 4.Effects of tanshinone ⅡA on the mRNA expression of GPX4，SLC7A11，p53 and FTH1 in the liver tissues of mice（Mean±SD. n=3）

讨 论

随着人们生活水平显著提高，饮食结构也有所改变，在高胆固醇饮食与高强度工作压力等因素下，心血管疾病的发病率逐渐增高，AS 为心血管疾病最主要的死亡因素，对其防治具有重要的意义。中医典籍中并无“动脉粥样硬化”这一病名，但据其不同的临床表现及受累部位，将其分散于“中风”、“眩晕”、“胸痹”、“脉痹”等病症中。窥其致病因素多有脏腑功能失调，气虚血瘀、痰浊、津液运行不畅等。中医理论讲到脾居中焦，主运化水谷精微。《医宗必读》曰:“脾土虚弱，清者难升，浊者难降，留中滞膈，瘀而成痰”。若脾失健运，则清阳不升，浊阴不降。脾为生痰之源，痰浊亦从水谷化生而来，且依赖于脾敷布周身，而后黏滞于血脉，日久瘀阻于脉络，逐渐形成AS［7］。由此可见，脂代谢紊乱是AS 发生发展最重要的危险因素之一［8］，因此调控脂代谢平衡即为防治AS主要手段之一。

丹参自古以来便作为活血化瘀的良药，具有祛瘀、凉血、养心除烦等功效，临床中血瘀、疼痛等症大多配伍此药。丹参酮ⅡA 是从丹参中提取的重要活性成分之一，其抗AS、抗心室肥厚、抗氧化、抗心律失常等药理作用都已明确［9］。

课题组前期研究发现，丹参酮ⅡA 具有抗炎、抗氧化的作用，且能够调控血脂水平，减少脂质沉积，采用高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠发现，丹参酮ⅡA 能够降低ApoE-/-小鼠肝脏 LDL-R 和 LCAT 的 mRNA 表达，从而减少肝脏脂质沉积［5，10-12］。本实验研究结果显示，模型组ApoE-/-小鼠血清中的TC、TG 和LDL-C水平显著升高，HDL-C 含量并无显著差异；HE 染色显示小鼠肝脏存在大量脂肪空泡，脂肪变性明显。相对于模型组而言，治疗组ApoE-/-小鼠血清中的TC、TG 和LDL-C 水平显著下降，肝细胞脂肪变性程度也明显减轻，提示丹参酮ⅡA 在降低ApoE-/-小鼠血脂水平的同时可减少肝脏脂质沉积。

铁死亡是由GPX4 活性丧失以及脂质ROS 大量累积所致的一种细胞死亡形式，这种由铁依赖的细胞死亡形式在遗传、生化和形态学上均不同于其他细胞死亡模式。2003 年，Dolma 等［13］发现由 erastin致死的RAS 突变的肿瘤细胞，没有细胞核形态学的改变及DNA片段化等。几年后，Yang等［14］研究证实这一过程可被铁螯合剂所抑制，并伴随细胞内脂质过氧化水平的大量增加。近几年研究发现，铁死亡与脂质代谢性疾病密切相关，脂质过氧化反应的发生可能是导致铁死亡发生所必需的条件之一［15］。GPX4 是一种抗氧化酶，作用于底物GSH 后，可将过氧化氢及脂质ROS 分别降解为水和相应的醇，可减少细胞内脂质过氧化的损伤，对细胞能否生存至关重要［16］。GPX4也是铁死亡环节中的关键因子，GSH是GPX4 的主要底物，若GSH 水平下降可导致GPX4丧失活性，GPX4的抑制将导致大量脂质过氧化物聚集进而致使大量ROS 产生，从而导致铁死亡的发生［17］。细胞膜上的转铁蛋白受体可将Fe3+转运进入细胞，多余铁则储存于铁蛋白之中。铁蛋白内含有FTH1 和铁蛋白轻链（ferritin light chain，FTL），可调控储存的铁离子［18］。膜钠离子依赖性胱氨酸/谷氨酸反向转运体（membrane Na+-dependent cysteine/glutamate antiporter，System xC-）是由重链亚基（CD98hc/SLC3A2）和轻链亚基（xCT/SLC7A11）组成的。System xC-可将胞内谷氨酸转移至细胞外，并将胱氨酸转移进来，细胞内的胱氨酸可用于GSH 的合成［19］。在细胞发生铁死亡的过程中p53、GPX4和FTH1均发挥了重要的作用。研究表明，p53 可抑制SLC7A11 的表达，阻止细胞对胱氨酸的摄取，进而降低GSH的合成并促进铁死亡的形成。此外，细胞内p53 的增加可致使细胞内ROS 的大量积累，并触发其诱导脂质过氧化反应，进而加速铁死亡的进程。本研究结果表明，模型组小鼠肝脏 GPX4、SLC7A11、p53 和FTH1的蛋白及mRNA 表达均显著升高，提示细胞铁死亡发生于AS 小鼠模型肝细胞的损伤过程，而引起肝细胞铁死亡发生的一系列相关因子GPX4、SLC7A11、p53 和 FTH1 可能是肝脏 ROS 含量升高、GSH 减少而致肝脏脂质过氧化发生的重要因素。经丹参酮ⅡA治疗后，小鼠肝脏GPX4、SLC7A11、p53 和FTH1 蛋白及mRNA 表达均显著降低，且高剂量比低剂量的效果更好一些，表明丹参酮ⅡA 具有抑制ApoE-/-小鼠肝脏细胞铁死亡的作用。

综上所述，丹参酮ⅡA 可通过拮抗肝细胞铁死亡相关因子进而实现对AS 小鼠肝脏的保护作用，也可降低肝细胞脂质过氧化的发生，从而减轻肝脏脂质沉积。本研究可为临床防治AS 肝脏疾病提供新靶点。