鞘氨醇激酶1通过ERK1/2信号通路促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移*

吕冰洁， 安 超， 郝 东， 王 涛， 王晓芝， 李洪波， 杨 阳

（滨州医学院附属医院 1呼吸与重症医学科，2临床营养科，3全科医学科，山东滨州256603）

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，全球肺癌的发病率和死亡率逐年上升，非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的约 80%［1］。尽管早期检测和标准治疗取得了进展，但NSCLC 在确诊时常常为晚期且预后不良［2］，因此，揭示NSCLC的分子机制和鉴定新的生物标志物可能对NSCLC的诊断和治疗非常重要。

鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）可将鞘氨醇转化为鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P），后者是一种重要的在肿瘤发生中调节细胞过程的生物活性脂质介体［3］，因此，SphK 也可能在肿瘤的进展中发挥关键作用。2 种功能性SphK 同种型（SphK1 和SphK2）已在哺乳动物细胞中被鉴定和描述特征［4］。研究显示，许多肿瘤（包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌和结肠癌）存在SphK1 的过度表达，且其与肿瘤的发展和患者的生存密切相关［5-8］。然而SphK1 是否参与NSCLC 的侵袭和转移及其机制尚不完全明确。Hojjat 等［9］和 Liu 等［10］分别在结肠癌细胞系LoVo和HT-29中发现SphK1可以促进细胞增殖和侵袭并抑制细胞凋亡，其机制可能与ERK1/2 信号通路的激活有关，故我们猜测SphK1 可以促进NSCLC的侵袭和转移，且这种作用可能与激活ERK1/2 信号通路有关。因此，本研究检测了SphK1 在NSCLC 临床标本中的表达，观察了SphK1 在NSCLC 细胞侵袭和迁移中的作用，并试图揭示其潜在机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 临床标本 本研究经滨州医学院附属医院伦理委员会批准。收集31 名NSCLC 患者肿瘤组织和匹配的正常肺组织。这些患者术前均未接受任何化疗或放疗。这些组织样本立即在液氮中储存或用甲醛固定以进行免疫组织化学染色。

1.2 细胞培养 人肺腺癌细胞系A549 购自中国科学院细胞库。将细胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.1 mg/L 链霉素和1×105U/L 青霉素的DMEM 培养液（Gibco）中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 试剂和仪器 ERK1/2 抑制剂U0126（Cell Signaling Technology）以 20 μmol/L 预处理 A549 细胞 30 min；用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）处理对照组。抗 SphK1、E-cadherin、fibronectin 和 β-actin抗体及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的 II 抗购自 Santa Cruz；抗 p44/42 MAPK（ERK1/2）和p-ERK1/2 抗体购自Cell Signaling Technology；TRIzol 试剂、cDNA 合成试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒和增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。NanoDrop 2000 分光光度计购自Thermo Scientific。

2 主要方法

2.1 RT-qPCR 根据制造商的说明书，使用TRIzol试剂提取总RNA；通过NanoDrop 2000分光光度计检测RNA 浓度和纯度；使用cDNA 合成试剂盒将2 μg总RNA 逆转录为cDNA。SphK1 的上游引物序列为5'-GGCTGCTGTCACCCATGAA-3'，下游引物序列为5'-TCACTCTCTAGGTCCACATCAG-3'；β-actin 的上游引物序列为5'-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3'，下游引物序列为5'-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'。RT-qPCR 条件如下:95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。最后，使用2-ΔΔCt法计算SphK1相对于β-actin的mRNA表达水平。

2.2 Western blot 实验 使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 缓冲液提取细胞裂解物，通过BCA 法评估总蛋白质的浓度。使用SDS-PAGE 凝胶分离等量的蛋白质，再将蛋白质转到PVDF膜上。使用TBST［10 mmol/L Tris（pH 7.4）、100 mmol/L NaCl和5%Tween-20］中稀释的5%牛血清白蛋白封闭PVDF 膜，加入I 抗［抗SphK1 抗体（1∶500），抗 E-cadherin 抗体（1∶500），抗 fibronectin 抗体（1∶250），抗p44/42 MAPK（ERK1/2）抗体（1∶1 000），抗p-ERK1/2抗体（1∶1 000），抗β-actin 抗体（1∶1 000）］4℃孵育过夜。将膜与HRP 标记的II抗在室温下孵育1 h，ECL显影。显影结果采用Image-Pro Plus 6.0 进行图像分析。

2.3 细胞转染 对于SphK1 的过表达，我们委托GenePharma 公 司构建含SphK1基因的 pcDNA3.1 载体pcDNA3.1-SphK1（SphK1 组），以空pcDNA3.1 载体为阴性对照（NC组）。根据制造商的说明，使用Lipofectamine™ 2000 试剂将 pcDNA3.1-SphK1 载体或空 pcDNA3.1 载体转染 A549 细胞，48 h 后进行后续实验。

对于SphK1的敲减，我们设计靶向SphK1基因的siRNA（siSphK1 组），其序列为5'-GCAGGCAUAUGGAGUAUGA-3'，以乱序 siRNA 为阴性对照（siNC组）。使用 Lipofectamine™ 2000 试剂将 siSphK1 或siNC转染A549细胞。48 h后，细胞用于后续实验。

2.4 细胞侵袭和迁移实验 细胞侵袭实验于具有Transwell 小室的24 孔板中进行，小室底部为孔径8 μm 的有孔聚乙烯膜（Costar）。用50 μL Matrigel（1 mg/L）包被Transwell小室底部膜的内表面，调整细胞密度为 1.0×105个将 200 μL 含 1% FBS 的细胞悬液置于上室，24 孔板下室加入 600 μL 含 30%FBS 的细胞培养液，在37℃、5%CO2的潮湿环境中温育16 h。16 h 后，非侵入性的细胞用棉签移除，穿过涂有Matrigel 的膜向下迁移的细胞用4%甲醛固定和结晶紫染色，然后在光学显微镜（×200）下拍照。选择7个随机视野进行细胞计数，计算平均数以反映细胞侵袭能力。除未在Transwell 小室底部膜表面铺Matrigel，迁移实验与侵袭实验方法一致。

3 统计学处理

每项实验重复3 次。使用SPSS 17.0 软件分析。正态分布的计量资料表示为均数±标准差（mean±SD）。两组之间均数比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 SphK1在NSCLC组织中高表达

RT-qPCR结果显示，与癌旁肺组织相比，NSCLC组织中SphK1 的mRNA 表达显著上调（P＜0.01），见图1A。为了分析 31 例 NSCLC 患者 SphK1 mRNA 表达水平与临床病理参数的关系，基于1.5 倍上调的截断值，将样本分成2 组:SphK1 高表达组（n=17）和SphK1 低表达组（n=14）。晚期NSCLC 患者的SphK1表达水平显著升高（P=0.012），而SphK1表达水平在患者性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤组织学类型和吸烟状况等方面的差异无统计学意义，见表1。另外，RT-qPCR 结果表明，SphK1 的 mRNA 表达水平随着肿瘤TNM 分期进展而增加，IV 期最高，I 期最低（P＜0.01），见图1B。

2 SphK1促进NSCLC细胞的侵袭和迁移

转染pcDNA3.1-SphK1 载体可使A549 细胞过表达SphK1，而siSphK1则抑制A549细胞中SphK1表达（P＜0.01），见图2A、B。过表达 SphK1 可促进 A549细胞的侵袭和迁移（P＜0.01），而敲减SphK1则抑制了A549细胞的侵袭和迁移（P＜0.05），见图2C、D。

Figure 1.Correlation between SphK1 expression and NSCLC progression.A:the mRNA expression of SphK1 in NSCLC tissues and adjacent lung tissues（n=31）；B:the mRNA expression of SphK1 in NSCLC tissues at I/II（n=14）and III/IV（n=17）stages.Mean±SD.**P＜0.01 vs adjacent tissues；##P＜0.01 vs I/II stages.图1 SphK1对NSCLC进展的影响

表1 NSCLC患者不同SphK1水平临床病理参数比较Table 1.Correlation analysis between SphK1 level and clinicopathological parameters in NSCLC patients

Figure 2.SphK1 promoted invasion and migration of NSCLC cells.A:the protein level of SphK1 was detected by Western blot analysis；B:SphK1 mRNA level was detected by RT-qPCR；C:effect of SphK1 on migration of A549 cells；D:effects of SphK1 on invasion of A549 cells.Scale bar=50 μm.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs siNC group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group.图2 SphK1促进NSCLC细胞的侵袭和迁移

3 ERK1/2 途径参与细胞侵袭和迁移，并调节上皮-间 充 质 转 化（epithelial-mesenchymal trasition，EMT）相关基因的表达

A549 细胞中 siSphK1 转染减少 fibronectin 表达，增强 E-cadherin 表达，并降低 ERK1/2 活化；而 SphK1过表达降低E-cadherin表达，增强fibronectin表达，并诱导ERK1/2活化（P＜0.05），见图3。

4 ERK1/2 参与调节 E-cadherin 和 fibronectin 表达及细胞侵袭和迁移

20 μmol/L U0126显著抑制了SphK1过表达诱导的 ERK1/2 磷酸化水平；与 DMSO 处理的 SphK1 组相比，U0126处理后fibronectin 表达显著下调，而E-cadherin 表达显著上调，见图4A。此外，抑制ERK1/2 信号通路显著抑制了A549 细胞的侵袭和迁移（P＜0.05），见图4B、C。

讨 论

作为SphK 家族的一个重要成员，SphK1 在细胞间和细胞内信号传导的调节中起着重要作用，在不同的肿瘤中均观察到SphK1 的过表达［5-7］。据报道，NSCLC 组织中SphK1 的表达显著增加，并与NSCLC患者的肿瘤进展和较差的存活率相关［11］。与之一致，本研究亦观察到SphK1 在NSCLC 组织中高表达且在晚期TNM 阶段表达更高，表明SphK1 在NSCLC进展中起着重要作用。

SphK1 在肿瘤的多种细胞过程中起调节作用，包括调节乳腺癌、前列腺癌和甲状腺癌细胞的增殖［7-8］。进一步研究表明，SphK1促进结肠癌、肝癌和卵巢癌细胞的侵袭和迁移［5，12］，提示 Sphk1 可能参与肿瘤转移。本研究观察了SphK1在NSCLC 细胞中的作用，结果显示过表达SphK1 可增强NSCLC 细胞的侵袭和迁移，而敲减SphK1则显著抑制了侵袭和迁移，这也进一步证实SphK1 是NSCLC 侵袭和转移的关键调节因子之一。

EMT 反映了肿瘤的侵袭和转移表型，并促进了包括肺癌在内的多种肿瘤的远处转移［13-14］。也有研究显示SphK1 在结肠癌HTC116 细胞EMT 过程中发挥重要作用［14］。我们在肺癌细胞中也观察到类似的变化，SphK1过表达抑制了肺癌细胞的迁移，上皮细胞连接蛋白E-cadherin 减少，间充质标志物fibronectin 增加。ERK1/2 作为预防和治疗与EMT 相关的转移性肿瘤的潜在靶标已受到广泛关注［15］，该通路也是导致肿瘤发生过程中细胞增殖、转移和EMT 的途径之一［13］。许多类型的癌症（包括肺癌）中的p-ERK1/2 水 平 升 高［16-17］。 而 SphK1对肺癌细胞中ERK1/2 信号通路的影响尚不明确。本研究结果显示，SphK1 的过表达刺激了ERK1/2 信号通路的激活，而敲减SphK1减弱了ERK1/2 信号通路的激活，表明SphK1 影响NSCLC 细胞中ERK1/2 信号通路途径的激活。ERK1/2 通路在肺癌组织中经常失调，并且在肿瘤的侵袭和转移中起关键作用［18］。本研究还发现，抑制ERK1/2途径减弱了SphK1介导的EMT 相关基因表达变化及细胞的侵袭和迁移，表明SphK1可能通过ERK1/2 途径调节NSCLC 细胞的EMT 过程及侵袭和迁移，靶向ERK 途径的药物或许可用于治疗过表达SphK1的肺癌。

Figure 3.SphK1 was involved in the regulation of p-ERK1/2，E-cadherin and fibronectin protein levels.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.05 vs siNC group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group.图3 SphK1参与调节p-ERK1/2、E-cadherin和fibronectin蛋白水平

Figure 4.ERK1/2 was involved in the regulation of E-cadherin/fibronectin expression（A），cell migration（B）and cell invasion（C）.The A549 cells were pretreated with U0126（20 μmol/L）or DMSO for 30 min.Scale bar=50 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC+DSMO group；#P＜0.05 vs NC+U0126 group.图4 ERK1/2参与调节E-cadherin和fibronectin表达及细胞迁移和侵袭

综上所述，SphK1 可能通过ERK1/2 途径调节NSCLC 细胞中的EMT 过程，并促进NSCLC 细胞的侵袭和迁移。