分枝杆菌培养系统分离诺卡菌的应用分析

沈晖，邬靖敏，宁兴旺，李军，王斌，陈东科(.长沙市第一医院检验科，长沙 0005；.湖南中医药大学第一附属医院检验科，长沙 0007；.中南大学湘雅医院检验科，长沙 0008；.北京医院检验科，北京 0000)

诺卡菌对培养基无特殊选择性，血琼脂、巧克力琼脂、缓冲活性炭酵母提取物琼脂等均可用于分离培养。为了提高诺卡菌的检出率，来自呼吸道含有诺卡菌的标本，可采用低pH(pH2.2)的HCl/KCl溶液进行预处理，亦可同分枝杆菌(Mycobacterium)培养方法用氢氧化钠-N-乙酰-L-半胱氨酸(NaOH-NALC)预处理标本。而提高诺卡菌属细菌培养阳性率的关键是掌握NaOH-NALC试剂暴露时间(15 min)，这同样适用于分枝杆菌分离培养[1]。本研究拟探讨分枝杆菌培养系统应用于诺卡菌分离的可行性。

1 材料与方法

1.1标本来源 2018年1月至2019年4月长沙市第一医院住院及门诊患者中临床疑似肺结核或肺部感染性疾病并按医嘱采集自然咳出晨痰或支气管肺泡灌洗液进行分枝杆菌培养的标本6 592份。标本来源分布为呼吸科2 387份、结核科2 385份、艾滋病科965份、心内科13份、内分泌科19份、血液肿瘤科16份、其他科室807份。

1.2主要试剂与仪器 NaOH、枸橼酸钠、磷酸盐缓冲液(天津恒兴化学试剂公司)，N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC,BIOTAL公司)，哥伦比亚血培养基、罗氏固体培养基(江门凯林公司)，萋-尼氏抗酸染色液(珠海贝索公司)；Bact/ALERT 3D全自动分枝杆菌培养监测系统及分枝杆菌培养瓶(MP培养瓶)、分枝杆菌抗生素补充检测试剂盒、Vitek MS质谱仪及Vitek MS分枝杆菌/诺卡菌试剂盒(法国生物梅里埃公司)，BSC-1500 ⅡB2-X生物安全柜、QP-80恒温培养箱(济南鑫贝西生物公司)，Veriti 9902 PCR扩增仪、3730XL基因测序仪(ABI公司)，LEICA DM3000显微镜(德国莱卡公司)。

1.3分离培养前处理 分枝杆菌培养前处理操作参照《结核病实验室诊断技术培训教程》[2]。NaOH-NALC前处理液配制：40 g/L NaOH溶液、29 g/L枸橼酸钠溶液等体积混匀并灭菌，用时按5 g/L浓度加入NALC，灭菌备用。将痰液、支气管肺泡灌洗液标本约5 mL置50 mL离心试管中，加等量的前处理液漩涡震荡1 min，静置15 min后加入无菌磷酸盐缓冲液(pH6.8)至50 mL，3 000×g15 min，去上清液并添加1 mL无菌磷酸盐缓冲液(pH6.8)以中和pH至6.8；MP培养瓶样本中加入0.5 mL分枝杆菌抗生素补充液，将消化后标本0.5 mL用一次性无菌注射器接种于MP培养瓶；放入Bact/ALERT 3D全自动分枝杆菌培养监测系统进行培养。前处理过程中去污染不彻底会发生污染，常见的污染菌包括真菌、细菌、放线菌(戈登菌和链霉菌)等，纳入污染标本统计。

1.4培养及鉴定 MP培养瓶阳性报警后取出并在生物安全柜中操作。取正常人血浆1滴于玻片中央，无菌注射器抽取培养液接种罗氏固体培养基并取数滴培养液与血浆混合涂片，置于80 ℃干燥箱中干燥，进行抗酸染色与弱抗酸染色镜检。培养阳性标本中诺卡菌形态学识别参照《临床微生物学手册》[1]：当发现具有抗酸性或弱抗酸性、长而纤细、分枝明显的菌丝或小串珠样短杆菌，再用无菌注射器抽取培养液接种血琼脂培养基，置37 ℃培养，数天后再次分纯培养。分纯后菌落用Vitek质谱仪进行鉴定，具体操作参照仪器说明书进行；对未成功鉴定菌株进行16S rRNA基因扩增与测序鉴定，引物序列为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，目的片段约1 500 bp，引物合成和测序委托北京睿博兴科公司。反应体系25 μL：Premix EX Taq 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR扩增参数为94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 72 s，35个循环；72 ℃ 7 min。PCR扩增产物用酒精纯化后加入高度去离子甲酰胺混匀，再转至ABI 3730XL基因测序仪进行Sanger双向测序，结果在PubMed上进行BLAST分析。

2 结果

2.1诺卡菌分离 MP培养阳性瓶经萋-尼氏抗酸染色、镜检，分枝杆菌呈抗酸性细杆状、稍弯曲、排列致密，并接种罗氏固体培养基分离、鉴定；诺卡菌经萋-尼氏抗酸染色可部分显示抗酸性或完全失去抗酸性，但长而纤细、排列疏松的分枝菌丝或串珠样排列的短杆菌特征明显，再采用弱抗酸染色重新镜检识别，并接种血琼脂和罗氏固体培养基分离、鉴定。见图1、图2。6 592份呼吸道标本检出分枝杆菌998份，阳性率为15.14%；诺卡菌58份，阳性率为0.88%；检出其他污染菌264份，污染率4.02%。

2.2诺卡菌鉴定 剔除重复送检分离菌株，51株诺卡菌中采用VITEK MS质谱鉴定48株，另3株质谱未获鉴定菌株经16S rRNA基因扩增与测序技术获得鉴定(分别为皮疽诺卡菌2株和新星诺卡菌1株)。菌种分布为皮疽诺卡菌44株、新星诺卡菌2株、盖尔森基兴诺卡菌2株、星形诺卡菌1株、豚鼠耳炎诺卡菌1株和非洲诺卡菌1株。

2.3诺卡菌检出患者资料 诺卡菌阳性标本包括痰液45份、支气管肺泡灌洗液6份；科室分布为呼吸科26株、结核科18株、艾滋病科4株和其他科室3株。患者平均年龄66.2岁，其中男性33人、女性18人。送检科室与诺卡菌菌种分布见表1。

表1 51株诺卡菌菌种与科室分布(n)

3 讨论

诺卡菌生长缓慢，而呼吸道标本中又常定植有大量非致病性或条件致病性微生物，因此造成常规呼吸道样本培养时诺卡菌的检出率较低。分枝杆菌培养时用NaOH-NALC预处理标本，可尽可能地清除无关微生物的干扰，在MP培养瓶中添加的分枝杆菌抗生素补充检测试剂(万古霉素、两性霉素、多黏菌素B)等抗菌药物可进一步地抑制杂菌生长。分枝杆菌培养体系中分离诺卡菌的关键是NaOH-NALC消化时间与培养阳性标本的正确染色、识别。Murray等[3]报道，将诺卡菌暴露于NaOH-NALC 30 min后，其活力降低，因此控制消化时间(15 min)可同时兼顾分枝杆菌与诺卡菌培养；培养阳性标本仅采用金胺O分枝杆菌荧光染色，诺卡菌形态学认识的缺乏会导致诺卡菌的漏检。诺卡菌弱抗酸染色可见抗酸性长而纤细、分枝明显菌丝，也可见抗酸性小串珠样不紧密相邻的球杆菌(见图1)，但采用萋-尼氏抗酸染色可部分显示抗酸性或失去抗酸性(见图2)。另将诺卡菌接种罗氏斜面培养基，发现约5.88%(3/51)的诺卡菌不能生长，因此诺卡菌培养需接种合适的培养基。

虽然MP培养瓶中加入了微量甲氧苄胺嘧啶，但是对2份(盖尔森基兴诺卡菌、豚鼠耳炎诺卡菌)支气管肺泡灌洗液抗酸染色提示诺卡菌标本的追踪，分枝杆菌培养系统均成功分离到诺卡菌，仪器报阳时间分别为6 d、10 d，甲氧苄胺嘧啶对诺卡菌培养阳性率的影响有待进一步研究。1例抗酸染色提示诺卡菌病例，多次培养未分离到诺卡菌，该患者在留取标本前已确诊肺诺卡菌病，并持续服用治疗剂量复方磺胺甲噁唑，推测可能由于诺卡菌蛋白质合成受阻、菌株活性降低，不能耐受NaOH-NALC的消化处理；而采用血琼脂培养及延长培养时间，仍可分离到诺卡菌。相同时间段采用直接接种血琼脂培养基分离培养时仅分离到5株诺卡菌，而分枝杆菌培养系统能分离多达51株诺卡菌(报阳时间3～14 d，平均7.18 d)。由此可见，作为临床微生物检验技术中常使用的琼脂培养基分区划线、分离培养的补充，采用NaOH-NALC预处理呼吸道标本的Bact/ALERT 3D全自动分枝杆菌培养系统可显著提高呼吸道标本中诺卡菌培养的阳性率。

连璐璐等[4]报道呼吸道标本中分离的31株诺卡菌中包括皮疽诺卡菌30株和卡尔涅亚诺卡菌(N.carnea)1株，分离菌种分布与本文结果相似。本研究皮疽诺卡菌的检出率(86.28%)高于泰国(35%)[5]和比利时(44%)[6]的报道，可能与地区差异有关。大多数诺卡菌菌种对绝大部分商品化生化试剂无反应，在种水平的鉴定需依赖基质辅助激光解吸电离飞行质谱(MALDI-TOF MS)技术或16S rRNA基因序列分析。本文采用VITEK质谱仪成功鉴定了51株诺卡菌中的48株(94.1%)，其余3株(皮疽诺卡菌2株、新星诺卡菌1株)无鉴定结果；推测与涂抹菌量、菌株新鲜程度有关，菌株生长缓慢(VITEK质谱分析要求孵育时间24～72 h)、嵌入琼脂较深不易挑取会导致菌体蛋白质的量不足，从而造成鉴定失败。

痰中分离到诺卡菌可能为定植、一过性感染或污染。免疫抑制患者或宿主防御缺陷的患者中痰培养诺卡菌阳性通常认定为感染，免疫正常患者痰中分离到诺卡菌但无明显感染症状时应密切随访[7]。在商品化诺卡菌选择性培养系统出现以前，采用NaOH-NALC去污染的Bact/ALERT 3D全自动分枝杆菌培养系统虽有所欠缺，但可显著提高呼吸道标本中诺卡菌培养的阳性率。