桂花浸膏中长链酯的测定及对香气成分释放的影响

吴 雷，席 辉，赵 龙，孙世豪*，宗永立，李河霖，张逸寒，马涛涛，柴国璧，张启东

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 吉林烟草工业有限责任公司，吉林省延吉市河南街天池路795 号 133001

3. 陕西中烟工业有限责任公司技术中心，陕西省宝鸡市高新大道100 号 721000

长链酯是植物蜡质的重要成分，广泛存在于植物的花、叶、果实和种子等器官中［1-3］。很多烟用天然香料中含有多种长链酯，且相对含量较高。长链酯主要是棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和亚麻酸的酯类物质，该类物质没有显著的气味特征，挥发性低，一般属于非香气成分。在前期的研究中，发现天然香料中的长链酯会影响香料中香气成分的释放，从而影响其香气，但目前相关文献报道较少。食品中也含有长链酯，它们会影响食品中香气成分的顶空浓度，从而影响食品的风味，目前已有较多文献报道［4-5］。Brauss 等［6］发现饼干中挥发性物质的释放与其脂肪含量有关，与高脂肪饼干相比，低脂肪饼干释放的茴香脑显著增加；Chung等［7］发现随着脂肪含量的增加，冰淇淋中苯甲醛和己醛的释放量减少，而香兰素的释放量增加；这些研究结果对食品工业有重要的指导作用。因此，研究香精香料中的长链酯对其香气成分释放的影响具有重要意义。

桂花浸膏是用石油醚［8-9］或超临界二氧化碳流体［10-11］萃取桂花，制得的天然香料香气浓郁优雅，是食品和烟草业常用的天然香料，近年来已有较多文献对其香气成分进行报道［12-14］。桂花浸膏中长链酯种类多、含量高［15-17］，但桂花浸膏相关研究文献中较少关注长链酯，且未涉及长链酯对桂花浸膏香气成分释放的影响。

本研究中，在前期对桂花浸膏的全成分进行定性分析和对桂花浸膏的主要香气成分进行定量分析［18］的基础上，采用GC-MS 对桂花浸膏中的长链酯进行定量分析，并采用大气压化学电离源质谱（Atmospheric pressure chemical ionization-Mass spectrometry，APCI-MS）和静态顶空－气相色谱－质谱联用（Static headspace-Gas chromatography-Mass spectrometry，SHS-GC-MS）考察长链酯对桂花浸膏香气成分释放的影响，旨在为桂花浸膏产品的开发、香精调配及其在烟草制品和食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

市售桂花浸膏样品分别购自广州日化化工有限公司（1#）、江西华宝天然香料油有限公司（2#）、中山联久生物科技有限公司（3#）、桂林拓普香料有限公司（5#）和无锡市赛力威生物科技有限公司（6#）。本实验室自制金桂桂花浸膏（4#）。5#和6#样品为银桂桂花浸膏，其余样品为金桂桂花浸膏。

肉豆蔻酸乙酯（＞98%）、十五酸乙酯（＞97%）、棕榈酸甲酯（≥99.5%）、亚油酸甲酯（＞95%）、亚麻酸甲酯（＞98%）、硬脂酸甲酯（＞97%）、硬脂酸乙酯（＞99%）、亚油酸乙酯（＞97%）（日本TCI 公司）；亚麻酸乙酯（≥98%）、棕榈油酸乙酯（＞95%）［阿拉丁试剂（上海）有限公司］；棕榈酸乙酯（＞97%，美国Alfa Aesar 公司）；苯甲酸芳樟酯（＞98%，美国Sigma-Aldrich 公司）。

CP224S 型电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius 公司）；KQ-800DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；大气压化学电离源串联质谱仪（XevoTMTQ-MS，美国Waters 公司）；7890A/5975C 气相色谱—质谱连用仪（GC-MS）、7694E 静态顶空进样器（美国Agilent 公司）。

1.2 方法

1.2.1 4#桂花浸膏制备

除去新鲜桂花中的杂物，按桂花和石油醚比例为1∶2（质量∶体积，kg∶L）搅拌浸提2 h，将浸提液与残渣分离；再用石油醚浸提残渣两次，浸提时间为0.5 h，所用石油醚体积为首次浸提时的0.25 倍，合并石油醚提取液，40 ℃减压浓缩得黄色浸膏。

1.2.2 长链酯定量分析

按照各成分的相对含量准确称取一定量的标准品于10 mL容量瓶，用乙醇定容到10 mL，配成混标母液，分别移取一定体积的母液（1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05 mL）于 10 mL 容量瓶，分别加入 1 mL质量浓度为101.2 μg·mL-1的苯甲酸芳樟酯溶液作内标，用乙醇定容到10 mL，配制成7 个浓度梯度的混合标准溶液，各取1.5 mL 进行GC-MS 分析。

准确称取一定量的桂花浸膏于10 mL 容量瓶，加入 1 mL 浓度为 101.2 μg·mL-1的苯甲酸芳樟酯溶液作内标，加入乙醇，在320 W 超声功率和40 ℃温度条件下超声20 min，使桂花浸膏充分溶解分散，用乙醇定容到10 mL，静置0.5 h，取1.5 mL 进行 GC-MS 分析。GC-MS 条件为：

色谱柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：He（99.999%）；进样量：1 μL；进样模式：分流进样，分流比10∶1；升温程序：起始温度100 ℃，以5 ℃·min-1升温至 265 ℃；进样口温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；EI 离子源温度：230 ℃；电离能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；扫描模式：选择离子监测；扫描范围：30～550 amu；溶剂延迟：5 min。各目标物选择离子参数见表1。

表1 11 种目标物的选择离子参数Tab.1 Selected ion parameters of 11 target components

1.2.3 桂花浸膏香气成分释放分析

以桂花浸膏中长链酯的定量分析结果和作者前期的研究［18］中对桂花浸膏的14 种主要香气成分定量分析的结果为基础，这14 种香气成分分别是顺式－氧化芳樟醇（呋喃型）、反式－氧化芳樟醇（呋喃型）、芳樟醇、苯乙醇、对乙基苯酚、反式－氧化芳樟醇（吡喃型）、顺式-氧化芳樟醇（吡喃型）、顺式－茶香螺烷、反式－茶香螺烷、对甲氧基苯乙醇、α－紫罗兰酮、二氢－β－紫罗兰酮、γ－癸内酯、β－紫罗兰酮。依据香气成分和长链酯在桂花浸膏中的含量，以乙醇为溶剂等比例复配2 个香精样品，其中香精样品1 只含有香气成分，香精样品2 含有香气成分和长链酯。

分别取1 mL 1#和2#香精样品于2 个10 mL 样品瓶中，拧紧瓶盖，在水浴温度30 ℃条件下平衡0.5 h，用APCI-MS分析其顶空成分。APCI-MS条件为：

离子化模式：正离子模式；离子源温度：50 ℃；电晕放电电流：5 μA；APCI 喷针温度：100 ℃；去溶剂气：N2（99.999%），流速为250 L·h-1；扫描模式：全扫描，扫描范围m/z100～400；碰撞气：Ar，流速为0.25 mL·min-1。

1.2.4 长链酯含量与香气成分释放量关系分析

利用桂花浸膏的14 种主要香气成分配制香气成分混合溶液（每种香气成分的质量浓度均为2 mg·mL-1）。根据1#桂花浸膏样品中长链酯定量分析结果，等比例配制长链酯混合溶液，其中亚麻酸乙酯浓度为2 mg·mL-1，并配制1 种浓度为2 mg·mL-1的亚麻酸乙酯溶液。上述溶液均以乙醇为溶剂进行配制。在10 个10 mL 的顶空分析样品瓶中分别加入表2 所示的溶液，静置1 h，用SHS-GC-MS 进行分析。SHS-GC-MS 条件为：

样品瓶加热温度：60 ℃，加热时间30 min；定量环温度：80 ℃；传输线温度90 ℃；样品瓶加压时间：0.2 min；定量环平衡时间：0.2 min；进样时间：1 min。进样模式：分流进样，分流比3∶1；升温程序：起始温度50 ℃，以5 ℃·min-1升温至210 ℃；扫描模式：全扫描；溶剂延迟：7 min；其他条件同1.2.2 节。

表2 不同长链酯含量溶液的配制表Tab.2 Formula of long-chain ester solution at different contents

2 结果与讨论

2.1 桂花浸膏中长链酯的定量分析

根据前期的研究结果［18］，长链酯在桂花浸膏中种类多，且含量高，其中11 种长链酯为桂花浸膏的共有成分，含量较高，是桂花浸膏中主要的长链酯，有较强的代表性。因此，选择这11 种长链酯为目标物，用内标标准曲线法对其进行定量分析。对定量分析GC-MS 条件进行优化，在节省时间的同时使色谱峰能较好地分离，桂花浸膏的GC-MS分析总离子流图见图1A，11 种长链酯标准品的GC-MS 分析总离子流图见图1B。

图1 1#桂花浸膏样品（A）和长链酯标准品（B）GC-MS 总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of sweet osmanthus concrete of sample No. 1（A）and long-chain esters standard solutions（B）analyzed by GC-MS

2.1.1 方法验证

利用1#桂花浸膏样品进行定量分析方法的验证，定量分析方法验证的结果见表3。各目标物的决定系数（R2）均≥0.998，线性关系良好，能满足检测要求。将最低浓度的混合标准溶液连续进GC-MS 分析 10 次，计算标准偏差（SD），以 3 倍和10 倍SD 作为检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果显示，LOD小于0.46 μg·mL-1，LOQ小于1.53 μg·mL-1，能满足检测要求。取桂花浸膏样品进行6 次平行处理和测定，计算相对标准偏差（RSD），各目标物的RSD≤6.71%，这说明方法的精密度较好。采用标准加入法测定回收率，根据样品的实测含量设置3 个添加水平，添加量分别为样品中各目标物含量的0.5 倍、1 倍和2 倍，各目标物回收率为85.4%～117.9%，这说明方法定量准确度高，适合于样品定量分析。

2.1.2 定量分析结果

6 个桂花浸膏样品中长链酯的定量分析结果如表4 所示。可以看出，在所选择的11 种长链酯中，金桂和银桂中含量最高的均为亚麻酸乙酯（23%～62%），其次为棕榈酸乙酯（12%～17%）、亚油酸乙酯（11%～20%）和亚麻酸甲酯（4%～16%），但金桂中这4 种长链酯的含量显著高于银桂，而其余长链酯在金桂和银桂中的含量差异较小，且金桂桂花浸膏中长链酯总含量（15.1～24.4 mg·g-1）显著高于银桂桂花浸膏中长链酯总含量（2.6～7.5 mg·g-1）。可见，金桂和银桂中长链酯含量具有较大的差异，这可能是导致两者香气差异的因素之一。对于同一种酸，桂花浸膏中乙基酯的含量一般高于甲基酯的含量，可能是由于桂花中香气成分的自然代谢所致。本实验室自制桂花浸膏（4#样品）中长链酯总含量偏高，可能是因为减压浓缩时间较长，溶剂残留少，导致浸膏中化学成分含量偏高。

2.2 长链酯对桂花浸膏香气成分释放的影响

用APCI-MS 对2 种复配香精样品的顶空成分进行分析，结果如图2 所示。图中的m/z153 为对甲氧基苯乙醇的［M+H］+峰，m/z171 和m/z341 分别为氧化芳樟醇（呋喃型）、氧化芳樟醇（吡喃型）、γ－癸内酯的［M+H］+和［2M+H］+峰，m/z193 为α－紫罗兰酮和β－紫罗兰酮的［M+H］+峰，m/z195为茶香螺烷和二氢－β－紫罗兰酮的［M+H］+峰。

表3 11 种目标物的回归方程、检出限、相对标准偏差和回收率Tab.3 Linear equations, LODs, RSDs and spike recoveries of 11 target components

表4 桂花浸膏样品中长链酯的含量Tab.4 Contents of long-chain esters in sweet osmanthus concrete

比较香精1 顶空成分的质谱图（图2A）和香精2 顶空成分的质谱图（图2B）可发现，图2B 中m/z171 和m/z341 的质谱峰强度高于图2A 中相应的质谱峰强度，说明长链酯的存在会使复配香精中氧化芳樟醇（呋喃型）、氧化芳樟醇（吡喃型）和γ－癸内酯的顶空浓度增大。图2B 中m/z193 的质谱峰强度小于图2A 中相应的质谱峰强度，说明在复配香精中加入长链酯后，α－紫罗兰酮和β－紫罗兰酮的顶空浓度减小。图2B 中m/z195 的质谱峰强度减小，说明在复配香精加入长链酯后，茶香螺烷和二氢－β－紫罗兰酮的顶空浓度减小。图2A与图2B 的质谱峰强度差异说明长链酯的加入会改变香气物质的顶空浓度，对桂花浸膏的香气成分释放有显著影响。

将香精1 和香精2 的香气与天然桂花浸膏的香气进行比较，发现香精1 化学气息重，刺激性较大，与天然桂花浸膏的香气差异较大。添加长链酯的2#香精与1#香精相比，化学气息和刺激性减弱，香气较为柔和，不同香韵之间更加协调，与天然桂花浸膏的香气接近。这说明长链酯能改善调配香精的香气，对桂花浸膏的香气有显著影响，是桂花浸膏的重要成分。

图2 1#香精样品（A）和2#香精样品（B）的APCI-MS 质谱图Fig.2 Mass spectra of flavor samples No. 1（A）and No. 2（B）by APCI-MS

2.3 长链酯含量与香气成分释放量的关系

为了进一步明确随着长链酯含量的变化，桂花浸膏香气成分顶空浓度的变化趋势，将亚麻酸乙酯溶液和长链酯混合溶液分别加入桂花浸膏主要香气成分混合溶液中，用SHS-GC-MS 分析其顶空成分，以各香气成分在总离子流图中的峰强度为纵坐标，加入的长链酯混合溶液或亚麻酸乙酯溶液的体积为横坐标作图，结果如图3 所示。加入长链酯后，各香气成分顶空浓度的相对变化值如表5 所示。其中氧化芳樟醇（呋喃型）和对乙基苯酚未检出，可能是因为这两种香气成分在此体系中的挥发性较低。

图3 长链酯对桂花浸膏香气成分释放的影响Fig.3 Effects of long-chain esters on releases of aroma components in sweet osmanthus concrete

图3 显示，在香气成分混合溶液中加入50 μL亚麻酸乙酯溶液后，苯乙醇、对甲氧基苯乙醇、α－紫罗兰酮、二氢－β－紫罗兰酮、γ－癸内酯、β－紫罗兰酮、芳樟醇和氧化芳樟醇（吡喃型）的顶空浓度急剧下降，继续加入亚麻酸乙酯溶液，其下降趋势变缓，当加入200 μL 亚麻酸乙酯溶液时，顶空浓度趋于稳定。茶香螺烷的顶空浓度随亚麻酸乙酯含量的增加逐渐下降，且下降趋势近似为直线。表5 显示，亚麻酸乙酯含量对α－紫罗兰酮、苯乙醇、对甲氧基苯乙醇、二氢－β－紫罗兰酮和β－紫罗兰酮顶空浓度的影响较大，当加入400 μL 亚麻酸乙酯溶液时，其顶空浓度分别下降了85.2%、84.4%、78.2%、76.5%和71.6%，这可能是由于苯乙醇和对甲氧基苯乙醇的羟基以及紫罗兰酮类物质酮-烯醇互变后的羟基与亚麻酸乙酯形成氢键所致。

在香气成分混合溶液中加入50 μL 混合长链酯溶液后，反式－氧化芳樟醇（吡喃型）、顺式-氧化芳樟醇（吡喃型）、γ－癸内酯和芳樟醇的顶空浓度升高，分别增加了20.8%、15.7%、9.0%和2.5%；当加入100 μL 混合长链酯溶液后，γ－癸内酯和芳樟醇的顶空浓度下降，而反式－氧化芳樟醇（吡喃型）和顺式－氧化芳樟醇（吡喃型）的顶空浓度继续升高，与不加长链酯相比，分别增加了33.2%和21.8%；继续加入混合长链酯溶液，上述4 种香气成分的顶空浓度均下降。顺式－茶香螺烷和反式－茶香螺烷的顶空浓度随混合长链酯含量的增加趋于直线下降，且顶空浓度变化最小，当加入400 μL 混合长链酯溶液后，其顶空浓度仅降低2.1%和3.7%，这可能是因为茶香螺烷与长链酯之间的分子间作用力较小，且不易形成氢键。

综上可知，桂花浸膏中长链酯的含量对桂花浸膏香气成分的释放量有显著影响，且同一种长链酯对不同香气成分的影响存在较大差异。加入亚麻酸乙酯与加入混合长链酯相比，同一种香气成分顶空浓度的变化呈现较大差异，这说明不同的长链酯对同一种香气成分释放量的影响存在较大的差异，一些长链酯会使某些香气成分的释放增强，一些长链酯则使其减弱。这与长链酯和香气分子的分子量、分子结构、极性、官能团、碳链长度、挥发性、熔点、沸点等理化性质有密切的关系［19-21］，有待于进一步研究。长链酯与香气成分释放量的关系表明，在开发新的香精香料产品和调香的过程中，可以在配方中加入适量长链酯，以增强或降低某些香气成分的释放量。

表5 加入长链酯后香气成分顶空浓度的相对变化Tab.5 Relative variation of headspace concentration of aroma components after adding long-chain esters

3 结论

①建立了用于桂花浸膏中长链酯定量分析的GC-MS 方法，本方法精密度较好（RSD≤6.71%），检出限低（LOD＜0.46 μg·mL-1），各目标物线性良好（R2≥0.998）。②对于6 个桂花浸膏样品而言，金桂和银桂桂花浸膏中含量最高的长链酯均为亚麻酸乙酯，其次是棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯和亚麻酸甲酯，但金桂桂花浸膏中长链酯总含量（15.1～24.4 mg·g-1）显著高于银桂桂花浸膏中长链酯总含量（2.6～7.5 mg·g-1）。③桂花浸膏中长链酯的存在会改变浸膏中香气成分的顶空浓度，且能显著改善桂花香精的香气，是桂花浸膏的重要成分。随着亚麻酸乙酯含量的增加，各香气成分的释放量均降低；随着混合长链酯含量的增加，反式－氧化芳樟醇（吡喃型）、顺式－氧化芳樟醇（吡喃型）、γ－癸内酯和芳樟醇的释放量先分别增加33.2%、21.8%、9.0%和2.5%，然后降低。④长链酯含量对桂花浸膏香气成分的释放量有显著影响，且对不同香气成分的影响存在较大差异。