再造烟叶浆料中有机酸质量分数随振荡时间的变化

李华雨，王茹楠，王小飞

河南卷烟工业烟草薄片有限公司技术中心，河南省许昌市金叶大道666 号 461000

制浆是造纸法再造烟叶生产的关键工艺之一，其浆料特性直接影响后续的生产过程和产品品质。浆料处理过程中，温度一般维持在40 ℃左右，系统中丰富的无机盐、多糖等［1-2］为微生物的生长提供了适宜的生长环境，导致浆料发酸、变质，严重影响产品的感官质量，并对生产线造成污染，影响生产效能。

目前，造纸行业浆料新鲜度的相关研究主要集中在浆料防腐［3-7］及微生物种类的鉴别方面［8-13］，薛长森等［9］对再造烟叶上网浆料中主要微生物群进行分离研究，发现引起浆料腐败变质的主要菌群为约氏不动杆菌和恶臭假单胞菌，但并没有明确微生物菌落数量与浆料变质程度的关系。吴芳芳等［10］对制浆造纸过程循环白水中的细菌多样性进行了研究，表明造纸白水具有较丰富的细菌多样性，以变形菌为优势菌群。再造烟叶生产过程中，浆料在密闭的管道中输送，厌氧细菌发酵为糖酶，释放出挥发性脂肪酸等代谢副产物［5-6,14］，挥发性脂肪酸包括甲酸、乙酸、丁酸、丙酮酸和戊酸等。

因此，采用离子色谱法［15-17］研究了浆料振荡时间与其中有机酸质量分数的关系，找出有机酸质量分数的变化规律，旨在为再造烟叶生产过程中浆料的驻留时间和工艺优化提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烟梗烟末（河南卷烟工业烟草薄片有限公司TS 品牌配方）；针叶纤维（乔治王子，加拿大）；阔叶纤维（鹦鹉，巴西）。

甲酸钠、戊酸钠（优级纯，天津市欧博凯化工产品销售有限公司）；乳酸钠、乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、丙酮酸钠、己酸钠（标准品，中国药品生物制品检定所）；柠檬酸钠、苯甲酸、酒石酸钠、草酸钠（标准品，德国Dr.Ehrenstorfer 公司）。实验用水为超纯水，电阻率大于18.2 MΩ·cm（25 ℃）。

ICS-6000 高压离子色谱仪（配置全自动在线电解淋洗液发生器、温控电导检测器）、ADRS600自动电解连续再生微膜抑制器（4 mm）、变色龙Chromeleon7.2 色谱工作站（美国赛默飞世尔公司）；0.22 μm 针头过滤器（天津富集色谱技术发展公司）；MD-3000 盘磨精浆机（巴西Regmed 公司）；SS 三足离心机（张家港永泰离心机制造有限公司）；DC-TQ 型实验室多功能提取罐（50 L，上海达程设备有限公司）；ZHP-2102L 恒温振荡培养箱（常州普天仪器制造有限公司）；Milli-Q 型超纯水仪（美国默克密理博公司）；RFS 微生物产气测量仪（美国Ankom 公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

取上述各试剂分别配制1 000 mg/L 的标准贮备溶液，放置于高密度聚乙烯瓶中，于4 ℃冰箱中保存，使用时稀释至所需浓度。

1.2.2 浆料的制备

烟梗烟末浆料（TS）：选取500 g 烟梗原料，采用多功能提取罐于60 ℃热水提取30 min，采用盘磨精浆机磨浆，将烟梗浆料以3 000 r/min 离心5 min；然后与500 g 配方烟末混合，60 ℃热水提取20 min，采用盘磨精浆机将梗和烟末混合磨浆；将梗末浆料以3 000 r/min 离心5 min。用60 ℃热水提取离心后的浆料10 min，以3 000 r/min 离心5 min；重复提取9 次。浆料含水率为79.19%，冷冻保存。

针叶纤维与阔叶纤维浆料（ZK）：针叶、阔叶纤维浆板，以针叶：阔叶=6：4（质量比）的比例共500 g，采用盘磨精浆机磨浆，将浆料以3 000 r/min离心5 min，然后用60 ℃热水提取10 min，再以3 000 r/min 离心5 min，重复提取3 次。浆料含水率为61.61%，冷冻保存。

1.2.3 不同振荡时间浆料样品的制备

新鲜浆料：称取冷冻保存的烟梗烟末浆料和针叶阔叶浆料各3.73 g，分别放入250 mL 磨口锥形瓶中，加入25 mL 自来水，摇匀后立即加入250 μL氢氧化钠水溶液（40 mol/L），以12 000 r/min 离心10 min，上清液过0.22 μm针头过滤器，冷冻待分析。

不同放置时间浆料样品的制备：称取3.73 g 冷冻保存的烟梗烟末浆料，放入250 mL 磨口锥形瓶中，加入25 mL 自来水，摇匀，共18 个瓶子，一式2份。一份用磨口瓶塞塞紧，一份用保鲜膜扎紧瓶口，然后在保鲜膜上用利器扎4 个孔，均放入恒温振荡培养箱中，温度保持50 ℃，振荡速率120 r/min。每隔1 h 取样，立即加入250 μL 氢氧化钠水溶液（40 mol/L）摇匀，以12 000 r/min 离心10 min，上清液过0.22 μm 针头过滤器，滤液冷冻待分析。不同振荡时间的针叶阔叶浆料样品的制备同烟梗烟末浆料的制备方法。高压离子色谱测试条件：

色谱柱：IonPac AG11-HC 浓缩柱（4 mm×50 mm）、IonPac AS11-HC 离子交换柱（4 mm×250 mm）、固相萃取柱（IonPac NG1、InGuard Na）；流动相：KOH 溶液，由淋洗液自动发生装置产生；梯度洗脱条件：0～15 min，KOH 浓度为 0.8 mmol/L；15～30 min，KOH 浓 度 由 0.8 mmol/L 升 至 12.0 mmol/L；30 ～ 45 min，KOH 浓度由 12.0 mmol/L 升至 38.0 mmol/L；45 ～ 50 min，KOH 浓度由 38.0 mmol/L 升至 50.0 mmol/L，保持5 min；50 ～ 55 min，KOH 浓度降至 0.8 mmol/L；流速：1.00 mL/min；柱温：30 ℃；检测池温度：35 ℃；抑制器电流：124 mA；进样体积：20 μL。

1.2.4 微生物产气

称取冷冻保存的烟梗烟末浆料33.26 g，一式3份，分别放入RFS 微生物产气测量仪的3 个250 mL 样品孵化瓶中，分别加入220 mL 自来水，放入恒温振荡培养箱中，保持温度50 ℃，以120 r/min的速率振荡20 h。

2 结果与分析

2.1 挥发性有机酸的分析

浆料制备过程中提取次数较多，烟草中的苹果酸、异戊酸、苯乙酸等残留较少，且实验中主要是考察浆料在振荡过程中细菌发酵释放出挥发性脂肪酸质量分数的变化，柠檬酸是发酵有机酸之一，因此考察浆料在振荡过程中乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、戊酸、己酸、酒石酸、草酸、苯甲酸和柠檬酸质量分数的变化。利用离子色谱阀切换和固相萃取原理，注入定量环（阀1）的样品被纯水带入IonPac NG1 和InGuard H 固相萃取柱，样品基质和重金属离子分别被截留在固相萃取柱NG1 和H 柱上，有机酸离子不被截留而进入后续浓缩柱AG11-HC（阀2）色谱系统进行分离，最后流进电导检测器；以有机相溶剂将截留在固相萃取柱上的样品基质清洗至废液中，实现固相萃取柱的清洗再生。具体分析流程见图1。

图1 样品中有机酸分离流程Fig.1 Separation process of organic acids in samples

取系列标准溶液，采用自动进样器，从低浓度至高浓度依次将其引入定量环，由淋洗液经六通阀载入阴离子交换柱，分离并检测各有机酸根离子。图2 为标样中各有机酸根均为1 mg/L 时以及浆料样品的分离色谱图，可知：各有机酸根可较好地达到基线分离；样品直接过滤后进样，有机酸也能得到有效分离。

图2 标准溶液和浆料样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of standard solutions and pulp samples

优化的色谱条件下，以各有机酸根离子的色谱峰面积为纵坐标（Y），浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，各有机酸根离子的线性回归方程见表1，相关系数均大于0.99，说明线性关系良好。草酸根与苯甲酸根在优化条件下于同一时间被淋洗（图2），用草酸根与苯甲酸根质量分数之和作线性方程定量草酸根与苯甲酸根的重合峰。取已知有机酸根质量分数的样品溶液进行加标回收实验，同一添加水平平行测定6 次，计算回收率。各有机酸根离子的回收率均大于95%，回收率的RSD均小于5%，说明此方法可靠性较好。

2.2 浆料封闭振荡状态下有机酸质量分数的变化

再造烟叶生产经过多级提取、制浆等工序，同时生产用水的一部分是循环水，很难保证浆料新鲜。为了真实反映新鲜浆料振荡时间与有机酸质量分数的关系，采用实验室磨浆、多次提取的方式制备新鲜浆料（1.2 节）。

将烟梗烟末配方浆料和外加纤维浆料分别封闭振荡1 ～9 h，样品中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、丙酮酸、酒石酸、苯甲酸+草酸（苯甲酸/草酸）、柠檬酸等有机酸根的测定结果如表2所示。

由表2 可知，由烟梗烟末制成的浆料经封闭振荡，浆料中有机酸质量分数随振荡时间而变化。其中，由于丙酸的量非常低，可忽略其随振荡时间的变化；乳酸、丁酸及戊酸的量也较低，随振荡时间变化无规律；丙酮酸和己酸的量稍高，随振荡时间呈无规律变化状态，振荡6 h 时质量分数均较高；苯甲酸/草酸、柠檬酸、酒石酸及甲酸在样品中的量较高，均随振荡时间延长变化无规律，酒石酸及甲酸在振荡6 h时质量分数最高；浆料中乙酸的量呈逐渐升高又降低的趋势，6 h时样品中质量分数最高。

表1 各有机酸根离子的线性方程、线性范围、相关系数、回收率和精密度Tab.1 Linear equations, correlation coefficients, recoveries and precisions of organic acid ions

表2 浆料封闭振荡不同时间样品中有机酸的质量分数Tab.2 Contents of organic acids in samples oscillated for different durations in closed state （mg·L－1）

外加纤维制成的浆料于50 ℃封闭振荡，乳酸、丙酸、丁酸、戊酸、丙酮酸及己酸的质量分数低且随时间延长变化无规律，丁酸、乳酸分别在振荡4、5 h 时质量分数最高，丙酮酸和己酸在振荡6 h时质量分数最高；柠檬酸、酒石酸和苯甲酸/草酸的量较高，柠檬酸质量分数随振荡时间基本无变化，酒石酸呈下降趋势，苯甲酸/草酸呈升高趋势（3 h 和7 h 的样品除外）；甲酸的质量分数较高，随振荡时间呈逐渐升高又平稳下降趋势，6 h 及7 h样品中甲酸质量分数均较高；乙酸的质量分数在振荡2 h 后呈逐渐升高又下降趋势，6 h 时样品中乙酸的质量分数最高。

烟梗烟末制成的浆料50 ℃封闭振荡1～9 h，有机酸总质量分数呈无规律变化（图3），6 h 时质量分数最高；外加纤维制成的浆料，其有机酸总量总体呈缓慢升高又下降趋势，6 h 时有机酸总量达最高值（图3）。

图3 封闭状态下不同振荡时间浆料样品中有机酸总量的变化Fig.3 Changes of total content of organic acids in samples oscillated for different durations in closed state

2.3 浆料敞口振荡状态下有机酸质量分数的变化

烟梗烟末浆料敞口振荡1～9 h 样品中各有机酸根测定结果见表3。可知，在测定的烟梗烟末浆料样品中，乙酸质量分数稍高，随振荡时间延长逐渐升高然后缓慢降低，5、6 及7 h 时质量分数均较高；柠檬酸、酒石酸、甲酸及苯甲酸/草酸质量分数较高，柠檬酸及酒石酸在振荡2 h 后质量分数基本无变化，甲酸及苯甲酸/草酸均随振荡时间变化无规律，苯甲酸/草酸在振荡5 h 时质量分数最高；己酸及丙酮酸的质量分数稍高，随振荡时间变化无规律；乳酸、丁酸及戊酸的质量分数低且随振荡时间变化无规律；丙酸的量非常低可忽略其变化。

外加纤维浆料样品中的甲酸及乙酸质量分数较高，甲酸的量随振荡时间变化无规律，乙酸总体呈逐渐升高又降低趋势，5 h 时均达到最高值；乳酸、丁酸、丙酮酸、戊酸及己酸的质量分数较低，随振荡时间变化无规律，丙酮酸在振荡5 h 时量最高；柠檬酸、酒石酸及苯甲酸/草酸的质量分数较高，酒石酸质量分数总体呈逐渐降低趋势，苯甲酸/草酸及柠檬酸质量分数总体呈逐渐升高趋势。

烟梗烟末浆料和外加纤维浆料50 ℃敞口振荡1～9 h，有机酸总量在7 h 内逐渐升高又下降，5 h 时达最大值（图4）。

图4 敞口状态下不同振荡时间浆料样品中有机酸总量的变化Fig.4 Contents of total organic acids in samples oscillated for different durations in open state

表3 浆料样品敞口振荡不同时间有机酸的质量分数Tab.3 Contents of organic acids in pulp samples oscillated for different durations in open state （mg·L-1）

2.4 相同振荡条件不同浆料中有机酸质量分数变化趋势的相关性分析

将烟梗烟末制成的浆料与外加纤维制成的浆料在50 ℃密闭振荡过程中有机酸质量分数的变化进行相关性分析，结果见表4。不同振荡时间的烟梗烟末浆料中己酸、丙酮酸、草酸/苯甲酸及酒石酸的变化趋势分别与外加纤维浆中己酸、丙酮酸、草酸/苯甲酸及酒石酸的变化趋势相关性不显著，烟梗烟末浆料中乙酸的变化趋势与外加纤维浆中乙酸的变化趋势显著相关（P＜0.05），烟梗烟末浆料中甲酸及柠檬酸质量分数在振荡过程中的变化趋势分别与外加纤维浆料中的变化趋势极显著相关（P＜0.01）。烟梗烟末浆料中有机酸总量的变化趋势与外加纤维浆中的相关性不显著。

50 ℃敞口振荡，烟梗烟末浆料与外加纤维浆料不同时间有机酸质量分数变化的相关性分析结果见表5。不同振荡时间的烟梗烟末浆料中乙酸、苯甲酸/草酸质量分数的变化趋势分别与外加纤维浆料中的变化趋势显著相关（P＜0.05），烟梗烟末浆料中甲酸、己酸及酒石酸质量分数在振荡过程中的变化趋势分别与外加纤维浆料中的变化趋势极显著相关（P＜0.01），丙酮酸和柠檬酸的质量分数在振荡过程中的变化趋势相关性不显著。烟梗烟末浆料中有机酸总量的变化趋势与外加纤维浆中的变化趋势极显著相关（P＜0.01），烟梗烟末浆料在振荡过程中有机酸总量的变化分别与其甲酸、己酸、丙酮酸和苯甲酸/草酸质量分数的变化趋势极显著相关（P＜0.01）。

2.5 浆料封闭振荡时间与产气压力的关系

采用微生物产气测量仪测量浆料封闭振荡状态下样品孵化瓶内的产气量，样品孵化瓶内产气量的变化表示微生物自然发酵产生气体的多少，可侧面反映样品中微生物新陈代谢的速率。以样品振荡时间为横坐标，3 个样品孵化瓶内产气量的平均值为纵坐标绘图（图5）。可知，封闭振荡5 ～7 h时微生物自然发酵产生气体量较大，与浆料中有机酸质量分数的变化规律一致。

表4 烟梗烟末浆料与外加纤维浆料在封闭振荡过程中有机酸质量分数变化的相关性分析①Tab.4 Correlation analysis between organic acid contents in tobacco pulp and fiber pulp oscillated for different durations in closed state

表5 烟梗烟末浆料与外加纤维浆料在敞口振荡过程中有机酸质量分数变化的相关性分析Tab.5 Correlation analysis on organic acid contents between tobacco pulp and fiber pulp oscillated for different durations in open state

图5 烟梗烟末浆料封闭振荡不同时间的产气量Fig.5 Gas production in tobacco pulp samples oscillated for different durations in closed state

3 讨论

烟梗烟末浆料及针叶阔叶浆料在封闭和敞口状态下振荡，甲酸质量分数变化无规律，封闭状态下烟梗烟末及针叶阔叶浆料中的乙酸缓慢升高后逐渐降低，敞口状态下针叶阔叶浆料中的乙酸质量分数逐渐升高后降低，烟梗烟末浆料中的乙酸随振荡时间缓慢升高为一恒值。封闭振荡烟梗烟末浆料中乙酸、甲酸质量分数的变化趋势分别与外加纤维浆料中极显著相关（P＜0.01）；敞口振荡烟梗烟末浆料中乙酸变化趋势与纤维浆料中显著相关（P＜0.05）、甲酸变化趋势极显著相关（P＜0.01）。再造烟叶生产过程中，浆料在密闭管道中的处理与输送时间一般不超过5 h，随着季节和车间温度的变化，有机酸质量分数的变化会稍有不同，可选择乙酸作为浆料的特征成分进行监控。

4 结论

（1）烟梗烟末浆料及针叶阔叶浆料分别于50 ℃封闭及敞口振荡1 ～9 h，浆料中各有机酸的量随振荡时间变化规律不同。烟梗烟末及针叶阔叶浆料中的乙酸随封闭振荡时间延长缓慢升高后逐渐降低，敞口振荡随时间缓慢升高为一恒值。针叶阔叶浆料中甲酸、乙酸及有机酸总量分别在封闭振荡6 h 和敞口振荡5 h 时质量分数最高。

（2）浆料封闭振荡5 ～7 h 时微生物自然发酵产气量达最大值，与浆料中有机酸量的变化一致。

（3）50 ℃封闭振荡烟梗烟末浆料中乙酸、甲酸质量分数的变化趋势分别与外加纤维浆料中极显著相关（P＜0.01）；敞口振荡烟梗烟末浆料中乙酸变化趋势与纤维浆料中显著相关（P＜0.05），甲酸变化趋势与纤维浆料中极显著相关（P＜0.01）。可选择乙酸作为浆料的特征成分进行监控。