基于UPLC-QTOF-MS技术对庐山云雾茶成分分析及真伪判别

刘 晔 王远兴

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

庐山云雾茶因产自江西省九江市的庐山而得名，是中国十大名茶之一。庐山凉爽多雾的气候使茶叶叶厚毫多，正是因独特的气候条件而造就了庐山云雾茶。庐山云雾茶含有较多的单宁、芳香油类和维生素，味道浓郁清香，怡神解泻，助消化，杀菌解毒。因茶叶中含有大量的茶多酚，故是抗氧化活性的天然化合物，多被应用于保健品和功能性食品中。

近年来，对庐山云雾茶的研究越来越多。庐山云雾茶产地的鉴别，如利用高光谱图像技术[1]、气相色谱质谱联用[2]。庐山云雾茶的营养成分的提取研究，如茶籽油脂肪酸[3]、茶多糖[4]、茶多酚的提取[5]。目前，多种现代分析技术（核磁共振、气质联用、液质联用）应用于茶叶的分析，其中液-质谱联用技术是复杂样品中化学组成分析和鉴定的重要分析工具，特别是具有高分辨率、高灵敏度的UPLC-QTOF-MS，它能够在缺少标准品的情况下对茶叶中微量成分进行结构分析并做初步鉴定[6]。Agilent Mass Profiler Professional 代谢组学软件（简称MPP 软件）经常被用于归属真伪鉴别、产品质量鉴定及工艺流程监控。利用气相色谱-质谱联用、液相质谱联用、核磁等手段对样品进行分离检测，采用安捷伦分析软件进行特征提取定量，最终用MPP 软件进行统计学分析。

目前，对庐山云雾茶详细的抗氧化活性成分及分离鉴定研究较少。本试验利用UPLC-QTOFMS 技术对庐山云雾茶醇提物进行定性分析，结合文献和数据库初步鉴定，利用MPP 软件进行统计学分析（构建PLS-DA 模型）。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

供试庐山云雾茶来源于通远镇（S1-S5），庐山茶科所茶场；赛阳镇，庐山露语茶业有限公司；星子县，星子县庐山七尖云雾茶有限公司，庐山市本地、市面上采买的测试茶叶样本。供试品均采于2016年5月份，样品放置于4 ℃冰箱中保存。

甲醇（色谱纯级），德国Merck 公司；甲酸（色谱纯级），ROE 公司；水，屈臣氏蒸馏水。

1.2 仪器与设备

Agilent1290 超高相液相色谱仪（四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD 检测器）、Eclipse Plus-C 18 column （4.6 mm×100 mm，3.5 μm）、Aglient6538 高分辨率飞行时间质谱仪，美国Agilent 公司；AL104 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ5200E 型超声波清洗器，机械昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A 型离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 样品预处理

准确称取茶叶粉末1.00 g 于50 mL 的离心管中，加入15 mL 甲醇溶液（70%），超声波提取1 h，离心4 800 r/min，10 min。重复提取上清液3 次，合并定容至50 mL。提取液放在4 ℃冰箱备用。

1.4 色谱和质谱条件

色谱条件：流动相：以0.1%甲酸水溶液为流动相A 和乙腈为流动相B 进行梯度洗脱，梯度洗脱：0～15 min：5%～20%（B）；15～25 min：20%～45%（B）。二级管阵列检测器（DAD） 波长：210，230，254，278，360 nm；柱温：25 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL。

质谱条件：负离子模式；电喷雾离子源（ESI）；离子范围：m/z 100～1 500；碰撞气：氮气；毛细管电压：3.5 kV；碰撞电压：175 V；碰撞能：10～50 V；干燥气流速：10.0 L/min；干燥气温度：300 ℃；雾化气压力：30 psi。

1.5 数据分析

采用安捷伦定性分析软件对化合物的母离子、碎片离子等信息进行分析。将分析得到的代谢指纹图谱数据导入MPP 12.1 分析软件中进行数据预处理，构建PLS-DA 模型对庐山云雾茶真伪判别。

2 结果与分析

2.1 庐山云雾茶醇提成分初步鉴定

庐山云雾茶提取液经UPLC-QTOF-MS 测定，在定性软件中根据提取液中化合物的保留时间、母离子、碎片离子等信息，利用数据库和相关类型文献对化合物做初步判断。鉴定结果见表1，总离子流图如图1所示。初步鉴定出93 种化合物，包括黄酮类：2 种异黄酮：染料木苷和染料木苷-5-O-糖苷。28 种黄酮醇：槲皮素-7-O-己糖苷，山奈酚，圣草素-O-己糖苷I，山奈酚-3-鼠李糖苷，二氢槲皮素-鼠李糖苷，山奈酚7-O-B-D-葡萄糖苷，夏佛塔苷，杨梅素芦丁糖苷，杨梅素己糖苷，紫云英苷，牡荆素-2″-O-糖苷，紫杉叶素己糖苷，槲皮素-3-O-糖苷酸，山奈酚二己糖苷，牡荆素，异牡荆素，芦丁，金丝桃苷，异槲皮素，刺槐素，异荭草素-2″-O-鼠李糖苷，异荭草素，荭草素-2″-O-鼠李糖苷，荭草素，柚皮素-4′-O-葡萄糖苷，槲皮素，大波斯菊苷。16 种黄烷醇：儿茶素吡喃葡萄糖苷，GC，EGC，C，EGCG，EC，GCG，ECG，CG，原花青素B2，原花青素B1等。5 种黄烷酮：柚皮素-8-Cβ-D-葡萄糖苷，柚皮素-6-C-β-D-葡萄糖苷，樱桃苷，柚皮素和柚皮素-4′-O-葡萄糖苷。11 种有机酸：葡萄糖酸，奎尼酸，草酸，异柠檬酸，富马酸，苹果酸，柠檬酸，柠苹酸，琥珀酸，羟甲基戊二酸和异丙基苹果酸。4 种氨基酸：茶氨酸，焦谷氨酸，亮氨酸和苯基丙氨酸。其余27 种化合物为酚酸。

2.1.1 黄酮类

1） 异黄酮 峰73 和峰75 的母离子[M－H]－m/z 431 分子式为C21H20O10，特征碎片离子均有m/z 477[M－H+HCOOH]－，m/z 269[M－H－C6H10O5]－，根据文献[10]判断其出峰顺序，化合物73 和75 分别为染料木苷及染料木苷-5-O-糖苷。

图1 庐山云雾茶70%甲醇提取物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of Lu Mountain Clouds-Mist tea in 70% methanol extracts

表1 庐山云雾茶70%甲醇提取物中鉴定的化合物Table 1 The chemical profiling in 70% methanol extract of Lu Mountain Clouds-Mist Tea

（续表1）

（续表1）

2） 黄酮醇 峰17、峰81 和峰82 的母离子[M－H]－m/z 463.0854 分子式为C21H20O12，特征碎片离子分别为m/z 301.0316 [M－H－C6H10O5]－，300.05[M－H－C6H11O5]－，271.0519[M－H－C7H12O6]－，179.0368 [M－H－C6H10O5－C7H6O2]－和151.0369 [MH－C6H10O5－C8H6O3]－，根据文献[10-11，16]推断出峰顺序，化合物17 可能是槲皮素-7-O-己糖苷，化合物81 可能是金丝桃苷，化合物82 可能是异槲皮素。峰51 的母离子[M－H]－m/z 593.1489 分子式为C27H30O15，特征碎片离子为m/z 285.0366[M－H－鼠李糖]－，根据文献[11]，化合物51 可能是山奈酚-3-鼠李糖苷。峰58、峰64、峰85 和峰87 的母离子[M－H]－m/z 447 分子式为C21H20O11，峰58，峰64 特征碎片离子为m/z 285[M－H－C6H10O5]－，根据文献[10]，化合物58 可能是山奈酚7-O-B-D-葡萄糖苷，化合物64 可能是紫云英苷，峰85 和峰87 根据文献[19]，初步断定出峰顺序，化合物85 可能是异荭草素，化合物87 可能是荭草素。峰69 的母离子[M－H]－m/z 465.1017 分子式为C21H22O12，特征碎片离子为m/z 303.4659[M－H－C6H10O5]－，259.05[MH－CO2－C6H10O5]－和241.1879[M－H－C8H13O7]－，根据文献[13]，化合物69 可能是紫杉叶素己糖苷。峰72、峰74 和峰93 的母离子[M－H]－m/z 431 分子式为C21H20O10，特征碎片离子均有m/z 269 [M－HC6H10O5]－，m/z 281[M－H－C5H9O5]－，根据文献[9，19]判断其出峰顺序，化合物72 和74 分别为牡荆素及异牡荆素。根据文献[16]判断峰93 可能是大波斯菊苷。峰77 的母离子[M－H]－m/z 609.1414 分子式为C27H30O16，特征碎片离子为m/z 301.0198[M－H－芦丁]－，根据文献[9]，化合物77 可能是芦丁。峰83 的母离子[M－H]－m/z 739.2094 分子式为C33H40O19，特征碎片离子为m/z 593.1496[M－H－鼠李糖]－和285.0407[M－H－鼠李糖－刺槐糖]－，根据文献[9]，化合物83 可能是刺槐素。峰92 的母离子[M－H]－m/z 301.0345 分子式为C15H10O7，特征碎片离子为m/z 273.0413[M－H－CO]－，257.8181[MH－CO2]－，229.8729[M－H－CO－CO2]－和179.8531[MH－C7H6O2]－，根据文献[9]，化合物92 可能是槲皮素。

3） 黄烷醇 峰24 的母离子 [M－H]－m/z 451.1221 分子式为C21H24O11，特征碎片离子为m/z 289.0729[M－H－吡喃葡萄糖]－，根据文献[9]，化合物24 可能是儿茶素吡喃葡萄糖苷。峰29、峰33、峰38 和峰41 的母离子[M－H]－m/z 为577 分子式为C30H26O12，特征碎片离子都为m/z 451 [M－HC6H6O3]－，425[M－H－C8H8O3]－，407[M－H－C8H10O4]－，289[M－H－C15H12O6]－，245[M－H－C16H12O8]－，161[MH－C21H20O8]－，125[M－H－C24H20O8]－，根据文献[10]，化合物29、33、38、41 可能是（表）儿茶素-（表）儿茶素n 和（表）儿茶素-（表）儿茶素（原花青素B）及其异构体。峰35 和峰48 的母离子[M－H]－m/z 289 分子式为C15H14O6，特征碎片离子均有m/z 271[M－H－H2O]－，m/z 245[M－H－CO2]－，m/z 203[MH－C5H10O]－，m/z 179 [M－H－C6H6O2]－，m/z 151 [MH－C7H6O3]－，m/z 109[M－H－C9H12O4]－，根据文献[10]判断其出峰顺序，化合物35 和48 分别为儿茶素及表儿茶素。

4） 黄烷酮 峰62、峰65、峰68 和峰89 母离子[M－H]－m/z 433 分子式为C21H22O10，特征碎片离子均有m/z 285 [M－H－C5H8O5]－和271 [M－HC6H10O5]－。根据文献[10]判断出峰顺序，化合物62可能是柚皮素-8-C-β-D-葡萄糖苷。化合物65 可能是柚皮素-6-C-β-D-葡萄糖苷。化合物68 可能是樱桃苷。化合物89 可能是柚皮素-4′-O-葡萄糖苷。峰80 的母离子[M－H]－m/z 271.0593，分子式为C15H12O5，特征碎片离子分别为m/z 151.0408[M－H－C8H8O]－和107.0126[M－H－C9H8O3]－，根据文献[15]，化合物80 鉴定为柚皮素。

2.1.2 有机酸

1） 酚酸峰15 的母离子[M－H]－m/z 169.0138，分子式为C7H6O5，特征碎片离子分别为m/z 125.0382[M－H－CO2]－，96.9591[M－H－CO－CO2]－和79.1828[M－H－CO－CO2－H2O]－，根据文献[10]，化合物15 可能是没食子酸。峰20 和峰23 的母离子[M－H]－m/z 315.0707 和315.0705 分子式为C13H16O9，特征碎片离子都为m/z 153.0213[M－HC7H6O4]－和109.3178[M－H－CO2－C7H6O4]－，根据文献[9]，化合物20 可能是原儿茶酸己糖苷，而化合物23 为其异构体。峰22、峰34、峰37 和峰42 的母离子[M－H]－m/z 353，分子式为C16H18O9，特征碎片离子均为m/z 191 [M－H－C7H12O6]－，179 [M－HC9H8O4]－和135[M－H－CO2－C9H8O4]－，表明这几个化合物为咖啡酰奎宁酸（CQA）的同分异构体。Sun等[17]研究了咖啡酰奎宁酸出峰顺序。单取代的洗脱顺序为3-CQA＞5-CQA＞4-CQA＞1-CQA，化合物25，37，39 和45 分别是3-CQA，5-CQA，4-CQA 和1-CQA。峰30，峰39，峰44，峰55，的母离子[M－H]－m/z 为337，分子式为C16H18O8，特征碎片离子均为m/z 191[M－H－奎宁酸]－，163[M－H－香豆酸]－，根据文献[19]，初步判断4 种化合物的出峰顺序，化合物30、39、44、55 分别是5-肉桂酰奎尼酸、4-肉桂酰奎尼酸、1-肉桂酰奎尼酸、5-O-肉桂酰奎宁酸。峰46 的母离子[M－H]－m/z 163.0393，分子式为C9H8O3，特征碎片离子分别为m/z 119.0496 [M－H－CO2]－，117.0386 [M－H－CH2O2]－和93.0342[M－H－C3H2O2]－，根据文献[9]，化合物46 可能是对香豆酸。

2） 氨基酸峰16 的母离子[M－H]－m/z 164.0706，分子式为C9H11NO2，特征碎片离子分别为m/z 147.0617[M－H2O]－，根据文献[9]，化合物15可能是苯基丙氨酸。

2.2 基于PLS-DA 模型对庐山云雾茶真伪识别

图2可以明显看出典型与非典型（掺假绿茶）庐山云雾茶的指纹图谱差异明显。为进一步对庐山云雾茶产地溯源分析，将所有庐山云雾茶样本UPLC-QTOF-MS 数据导入MMP 软件中进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。PLS-DA 是常见的有监督判别分析，是一种多因变量对多自变量的回归建模方法。在一个算法下，同时实现回归建模（多元线性回归）、数据结构简化（主成分分析）及两组变量之间的相关性分析（典型相关性分析）。图3为3 个产地庐山云雾茶及测试茶样偏最小二乘判别分析的三维得分图。红色圆点代表通远镇庐山云雾茶样本，蓝色圆点代表赛阳镇庐山云雾茶样本，棕色圆点代表星子县庐山云雾茶样本。灰色和绿色圆点都是测试茶样，其中灰色的和正宗庐山云雾茶汇聚在了一侧，判定这些茶叶样本为正宗庐山云雾茶。而绿色的茶样远离其它正宗庐山云雾茶，判定这些茶叶样本为非庐山云雾茶。从得分图中就能够明显区分掺假茶叶和正宗庐山云雾茶样本，判别率为100%。

图2 典型与非典型庐山云雾茶指纹图谱Fig.2 Typical and atypical Lu Mountain Clouds-Mist Tea fingerprints

图3 庐山云雾茶的偏最小二乘判别分析三维得分图Fig.3 PLS-DA 3D score plots of Lu Mountain Clouds-Mist Tea

表2 庐山云雾茶样本PLS-DA 模型预测矩阵Table 2 PLS-DA training result views of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples

图4 庐山云雾茶PLS-DA 得分图（a）和载荷图（b）Fig.4 PLS-DA score plots （a） and loading plots （b） of Lu Mountain Clouds-Mist Tea

图4是庐山云雾茶PLS-DA 模型的得分图（a）和载荷图（b）。从得分图中可知，庐山云雾茶样本可以分为5 类，掺假绿茶（绿色的点）明显远离其它4 类正宗庐山云雾茶。说明掺假绿茶可以很好的根据PLS-DA 模型区分出来。载荷图中每一点代表一种潜在标志物，离中心点和坐标轴越远，对模型的影响越大，即对不同样本的分组贡献率越高。图4中载荷图（b）中最左边和最右边符号代表的化合物就是对典型与非典型庐山云雾茶分组贡献最大的化合物。

模型预测矩阵如表2所示，根据概率统计，构建的庐山云雾茶PLS-DA 模型能够有效判别庐山云雾茶的产地。不同产地庐山云雾茶判别率为100%。说明本试验构建的PLS-DA 模型能够较好的区分掺假绿茶和正宗庐山云雾茶。

3 结论

本试验利用UPLC-QTOF-MS 分析庐山云雾茶提取物中抗氧化活性成分，结合相关文献和数据库进行比对，初步鉴定出93 种化合物，包括2种异黄酮，28 种黄酮醇，16 种黄烷醇，5 种黄 烷酮，11 种有机酸，4 种氨基酸，27 种酚酸。构建PLS-DA 模型，结合模型预测矩阵结果，掺假绿茶与正宗庐山云雾茶能够很好的区分开，判别率为100%。本研究为庐山云雾茶的真伪判别建立了一种快速通用的方法。