含油污泥生物电化学系统的产电性能及阳极膜菌群变化特征

郭海莹, 魏立新, 耿孝恒, 贾新磊, 霍洪俊, 王鹏华, 黄春峰, 唐善法*

(1.长江大学石油工程学院，武汉 430100；2.滨州学院化工与安全学院，滨州 256600；3.常州大学石油工程学院，常州 213164)

含油污泥是原油开采储运过程中产生的油、水等的混合废物，会影响人体健康和环境质量[1]。因此，必须对其资源化无害化处理，使其处理残余物达到国家环保要求。而现有其他资源化处理方法则均需对含油污泥进行必要的油泥分离或高温热解，造成分离过程复杂、成本较高，且存在二次污染风险。

生物电化学系统是利用微生物催化氧化有机物并将有机质中化学能转变成电能的新型系统[2-3]。但受多种因素的影响系统输出电压及功率密度始终不高[4-5]。沉积型生物电化学系统，发现其启动时间短，产电效能高，它不需要质子交换膜，结构相对简单，将阳极插入相对缺氧的被修复底物中，阴极放在上层富含氧气或氧化物的阴极液中，通过外接电路就可进行电子的传递[6-7]。同时，在底物中的阳极会为其提供连续且稳定的受体，加快有机物的代谢过程，从而实现其底泥修复的功能[8]。为此，将该沉积型生物电化学系统运用于油泥处理，既能利用微生物降解油泥中的石油等有机物，同时还能输出电能，实现保护环境和产电节能的双赢。

阳极生物膜的电活性会直接影响生物电化学系统的产电和降解性能[9]。有研究表明，以丙酸为阳极底物阳极生物膜优势菌群为壁厚菌门，而以丙酸、丁酸和葡萄糖为底物的生物电化学系统优势菌群为β-变形菌门(Proteobacteria)，尤以葡萄糖底物的微生物群落丰富度最高。阳极膜微生物组成和丰度会因阳极底物不同而表现出明显差异[10-11]。

鉴于此，构筑了以含油污泥为底物的单室无膜沉积型生物电化学系统，并探讨了该系统的产电效能及阳极膜微生物特征。通过系统输出电压、功率密度曲线、极化曲线及循环伏安测试，考察系统的产电性能；同时，采用生物宏基因组分类测序分析产电稳定阳极碳毡上和初始含油污泥的微生物群落组成及丰度，以期了解以含油污泥生物电化学系统的阳极膜菌群变化特征。

1 实验

1.1 生物电化学系统的构筑及运行

实验采用的是单室无膜的沉积型生物电化学系统，有效体积为2 L(图1)。含油污泥来自胜利油田，含油率为40.71%，含水率为10.70%。含油污泥与培养基，以9∶1的比例均匀混合后，取1 L沉积于系统底部，上部为阴极液[12]，体积为1 L。阴阳两电极均采用经预处理的圆形石墨毡(厚度为10 mm，直径分别为80 mm)，阳极埋于含油污泥中，阴极浮于阴极液表面且与空气相接触，两极间距为12.5 cm。阳极和阴极通过铜导线与外电阻(500 Ω)相连，外电阻两端连接数据采集系统，与电脑相连导出数据，数据采集器每隔10 min记录一次。装置于恒温培养箱[(31±1) ℃]中进行，电池运行期间定期添加阴极缓冲液。

图1 含油污泥沉积型生物电化学系统示意图Fig.1 Schematic diagram of oily sludge bioelectrochemical system

1.2 产电性能测试方法

1.2.1 输出电压、功率密度及极化曲线

系统产电过程中，输出电压、功率密度等可用于评价系统产电效能。系统输出电压可由数据采集器直接获得。由P=UI/A，I=U/RA得出功率密度和电流密度，其中，I表示电流密度(mA·m-2)；U表示电压(mV)；R表示外接电阻(Ω)；P表示阳极功率密度(mW·m-2)；A表示阳极有效面积(m2)。

在系统发电稳定期间，改变外接电阻大小，变化范围0～9 000 Ω，当0～10 Ω时，调节间隔为1 Ω，10～100 Ω时，调节间隔10 Ω，100～900 Ω时调节间隔为100 Ω，1 000～9 000 Ω时，调节间隔为1 000 Ω；测量时每改变一次电阻待MFC稳定10 min后记录数据。测得数据计算电流、电流密度及功率密度并做出系统的功率密度曲线与极化曲线。

1.2.2 循环伏安曲线测试

系统的循环伏安(CV)曲线通过电化学工作站(CHI660E，上海辰华仪器有限公司)进行测试。采用三电极体系：对电极采用铂丝电极，Ag/AgCl 电极(+0.195 V，标准氢电极电位)为参比电极，对系统中的阳极膜进行CV循环伏安扫描时，阳极为工作电极，电位扫描的范围为-1.5～1.5 V，扫描速度为10 mV/s。

1.3 阳极膜菌群变化特征

1.3.1 DNA提取

采用生物宏基因组分类测序的方法分析阳极碳毡及初始油泥中的微生物种群结构。分别提取初始油泥和产电稳定期阳极碳毡微生物DNA。

1.3.2 聚合酶链式反应

对提取的DNA进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增，选取 V4-V5 区作为扩增引物515F(5＇-GTGCCAGCMGCCGCGG-3＇)和907R(5＇-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3＇)。

1.3.3 操作分类单元的获得

通过Illumina MiseqTM平台测得序列，通过拼接及筛选后，在相似度97%下，将数据聚成操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)。

1.3.4 生物群落组成及丰度分析

获得的OTU通过核糖体数据库(ribosomal database project, RDP)数据库 (http://rdp.cme.msu.edu/)中的Classifer程序进行检索分类，按照文献[13]的分析方法分析群落的组成、相对丰度。

2 结果与讨论

2.1 系统产电性能分析

2.1.1 输出电压、功率密度及极化曲线

系统输出电压随时间变化如图2所示，系统电压在0～12 d逐渐上升； 12～20 d，输出电压基本稳定在300 mV左右，期间最大产电压为Vmax=320.7 mV；20～30 d，电压逐渐下降。图3为12～20 d即系统产电稳定期的极化曲线和功率密度曲线。可知，随着外电阻的减小，输出的电流密度先增大后减小，且输出电压逐渐减小。由功率密度-电流密度曲线(功率密度曲线)可得，当电流密度为183.13 mA·m-2时，输出的功率密度最大为Pmax=3 353.7 mW·m-2，此时外接电阻为500 Ω左右。研究表明，电子从阳极向阴极的流动会受外阻的控制，因此外阻值会影响系统产电性能[14]。由极化曲线可知，系统符合电流密度与输出电压之间呈直线关系的规律(V=-1.036i+324.96，相关系数0.98)。根据电流与电压间关系式V=ε-ir(ε为电动势，V为输出电压，i为电流，r为内阻)，可得电池电动势为324.96 mV，电池内阻值为509.73 Ω。由此可以得出，系统的内阻与功率输出最大值时的外阻值(500 Ω)相接近。

图2 系统输出电压随时间变化Fig.2 The output voltage change of the system with time

图3 极化曲线和功率密度曲线Fig.3 Polarization and power density curves

2.1.2 循环伏安曲线分析

循环伏安曲线(CV)能确定活性微生物氧化还原反应有机物的中心电位，同时明确阳极膜菌群的催化能力大小、电子传递能力及极限电流的大小等[15]。图4为系统阳极生物膜不同产电时期的CV曲线。可以看出，在产电初期(0 d)，阳极生物膜循环伏安曲线光滑，表明氧化还原反应不明显。在产电稳定期(15 d)，CV曲线呈“S”形状，说明产电微生物的催化作用与有机物的降解具有耦合效果，与之前报道结果一致[16]。氧化还原峰分别在0 V和-0.5 V，极限电流值为0.12 A/cm2，表明该阳极生物膜具有较强电活性。系统产电30 d时，CV曲线光滑即无氧化还原峰。

图4 阳极循环伏安曲线Fig.4 Cyclic voltammetry curve for anode electrode

2.2 阳极膜菌群变化特征

2.2.1 多样性指数

初始油泥(YN1)和系统处于产电稳定期的碳毡(TZ)的多样性指数如表1所示，在样本覆盖度(coverage)为0.96条件下，YN1的Seq 数、AEC指数、Chao1分别为55 020、50 398.64、22 327.10均高于TZ(50 149、31 064.92、15 617.76)，这表明系统处于产电稳定期的阳极膜比对应初始油泥的微生物菌群多样性降低，这与前人报道具有一致性[17]。

表1 油泥及阳极膜中微生物菌群多样性指数

2.2.2 群落结构组成、相对丰度及差异性分析

图5是系统处于产电稳定期的碳毡(TZ)和原始油泥(YN1)菌群组成及相对丰度图(图5)，并进一步对比两者菌群存在的差异性(图6)。由图5(a)可知， TZ、YN1的菌群组成主要有变形菌门(Proteobacteria)(46.39%、30.94%)、厚壁菌门(Firmicutes)(23.84%、45.5%)、绿弯菌门(Chloroflexi)(12.07%、9.29%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(6.94%、4.94%)。从门水平来看， Proteobacteria为TZ的优势菌群，这与以其他有机质为阳极底物的生物电化学系统具有一致性，Firmicutes为YN1优势菌群，其能在胞外进行电子传递，是产电微生物群落的重要组成[17]。结合图6(a)可知，YN1上Firmicutes相对丰度增大为TZ的1.5倍。研究表明，Bacteroidetes 和 Chloroflexi 都包含有多种产电菌[18]。

图5 初始油泥(YN1)及碳毡(TZ)微生物菌群组成及相对丰度对比Fig.5 Composition and abundance of microbial communities at different levels on the anode surface and Initial oil sludge

图6 油泥(YN1)及碳毡(TZ)微生物菌群组成差异性图Fig.6 Difference diagram of microbial flora composition of sludge (YN1) and carbon felt (TZ)

在纲水平上，相对丰度大于5%的菌群如图5(b)所示，TZ和YN1中均为梭菌纲(Clostridia)(21.99%，40.04%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)(20.12%，14.94%)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)(18.81%，13.33%)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)(11.56%，9.03%)。YN1中Clostridia的相对丰度是TZ的1.8倍，有研究表明，梭菌纲(Clostridias)可通过胞外传递电子[19]。YN1中Alphaproteobacteria、Anaerolineae 和Gammaproteobacteria的相对丰度均低于TZ。Anaerolineae 纲属于Chloroflexi门，是由Yamada 等通过 16SrRNA 基因分析，构建系统进化树而发现并命名，最适宜在 37 ℃左右、严格厌氧条件下生存，生长最适 pH 为 7.0[20]，因此，广泛存在于系统中。

在目水平上，相对丰度大于5%的菌群如图5(c)所示。TZ中有梭菌目(Clostridiales)(22.01%)、厌氧绳菌目(Anaerolineales)(11.72%)、拟杆菌目(Bacteroidales)(5.63%)、红育菌目(Rhodobacterales)(6.2%)、Rhizobiales(9.99%)、假单胞菌目(Pseudomonadales)(13.26%)。其中，相对丰度与YN1相差最大的是Pseudomonadales。有研究表明，Pseudomonadales分泌的介体既能提高其自身的产电降解能力，也能为其他菌属提供电子传递的中介体[21]。

在属水平上[图5(d)、图6(b)]，TZ与YN1差异性较大主要集中在Proteiniclasticum、Pseudomonas。Proteiniclasticum在YN1(39.43%)中的相对丰度是TZ(15.83%)的2.5倍，Proteiniclasticum属于厚壁菌门。

3 结论

(1)构筑了以含油污泥为阳极底物的单室无膜沉积型生物电化学系统，研究发现系统最大输出功率、产出电压为3 353.7 mW·m-2、320.7 mV。阳极生物膜具有较强电活性，循环伏安曲线呈“S”形状，氧化还原峰分别在-0.5 V和0 V，极限电流值为0.12 A·cm-2。

(2)系统产电稳定期阳极膜(TZ)相比于相应的初始沉积物(YN1)的菌群多样性降低，且两者微生物组成及相对丰度有较大差别，在TZ表面的微生物主要为Proteobacteria，YN1占优势的微生物为 Firmicutes。该技术既能高效、清洁资源化利用含油污泥，又能有效避免油泥分离且输出电能，具有良好的产业化前景。