菌渣中青霉素对蔬菜种子萌发的生态毒性效应

2020-08-01许继飞刘宏博崔思嘉周睫雅王旭明田书磊

环境科学研究 2020年7期

关键词：芽长油麦根长

马双, 许继飞, 刘宏博, 吴昊, 崔思嘉,3, 周睫雅,4, 王旭明, 田书磊*

1.内蒙古大学生态与环境学院, 环境污染控制与废物资源化自治区重点实验室, 内蒙古呼和浩特 010021

2.中国环境科学研究院固体废物污染控制技术研究所, 北京 100012

3.东北电力大学化学工程学院, 吉林吉林 132012

4.河北科技大学环境科学与工程学院, 河北石家庄 050080

5.北京市农林科学院, 北京农业生物技术研究中心, 北京 100097

作为一种杀菌和抑菌药物，抗生素广泛应用于人们和动物的疾病防治过程中，如在新冠肺炎疫情中，患者后期易继发细菌或真菌感染，抗生素可对该类患者进行及时有效救治[1]. 但抗生素生产过程中会产生大量的抗生素菌渣，按1 t抗生素产生8～10 t的菌渣估算[2]，我国仅在2013年就产生了2.48×106t左右的抗生素菌渣[3]. 抗生素菌渣主要是由抗生素生产过程中发酵微生物菌体细胞、无机盐、未发酵的固体有机物、提取抗生素过程中的残余有机溶剂和残留的抗生素等组成[4]. 因抗生素中含大量有机质[5]、N、P、K和多种微量元素[2]，肥料化是实现其资源化利用的较好途径. 但菌渣中残留的抗生素直接进入环境中可能会构成环境风险[6-7]. 调研结果发现，不同企业或不同生产工艺中抗生素残留量存在差异，螺旋霉素鲜菌渣中螺旋霉素残留量为750～800 mgkg[8]，青霉素鲜菌渣中青霉素残留量为260～300 mgL，头孢菌素鲜菌渣中头孢菌素残留量为530～550 mgL，若未经无害化处理直接进入土壤、水体等环境介质中会促使耐药性细菌的产生及抗生素抗性基因的富集，对人体健康和生态环境造成潜在的巨大危害[9-11]，因此在对抗生素菌渣进行资源化利用前必须进行无害化处置以去除抗生素. 但目前我国尚缺少抗生素菌渣无害化处置技术要求、肥料中抗生素残留以及土壤使用后生态风险评估等相关标准与技术规范. 中国环境科学研究院与抗生素菌渣国家工程技术中心已向国家标准化管理委员会提出制订青霉素等典型大宗抗生素菌渣作为有机肥基料的无害化处置技术要求、环境风险评估方法等相关技术规范的立项申请并通过专家讨论，将于2020年底完成立项程序，以期为抗生素菌渣肥料化利用奠定基础.

菌渣中抗生素残留量对蔬菜种子萌发的生态毒性效应是抗生素菌渣肥料化利用标准中一项重要的考量指标. 油麦菜、油菜、白菜和生菜作为人们日常食用频率较高的蔬菜，因其生长周期短、本体短小、易受抗生素影响等特点，已被国内外学者广泛用于评估抗生素对植物种子萌发的生态毒性效应[12]. Hillis等[13]就磺胺类和大环内脂类等抗生素对莴苣的生态毒性进行了研究，发现金霉素、左氧氟沙星和磺胺甲恶唑的生态毒性最为显著. WANG等[14]采用水培法分别研究了土霉素和盐酸多西环素浓度为0～90 mgL、乳酸恩诺沙星浓度为0～320 mgL时对油菜的生态毒性效应，发现在设定浓度范围内各种抗生素对根长的抑制作用均强于芽长. 刘娣等[15]的研究结果表明，白菜对四环素类抗生素的敏感性为根长>发芽率. PAN等[16]发现，生菜对四环素、磺胺二甲嘧啶、诺氟沙星和红霉素等兽用抗生素较敏感，主要体现在其根长受到明显的抑制作用. 然而目前国内外关于环境中青霉素(Penicillin，简称“PG”)对蔬菜的生态毒性效应尚不明确，可利用的生态毒性效应数据也很少.

该试验以油麦菜、油菜、白菜和生菜为研究对象，以发芽率、幼苗鲜质量以及根长和芽长作为重要指标，分析不同ρ(PG)对4种蔬菜种子萌发的生态毒性效应，并对ρ(PG)和蔬菜根长抑制率进行剂量-效应关系拟合，以期为建立青霉素菌渣肥料化利用相关标准提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试4种蔬菜种子分别为油麦菜(Lactucasativavar longifoliaf. Lam)、油菜(BrassicacampestrisL.)、白菜〔Brassicapekinensis(Lour.) Rupr.〕和生菜(LactucasativaLinn. var. ramosa Hort.)，购于北京派得伟业科技发展有限公司；试验所用青霉素为伊犁川宁生物技术有限公司生产的青霉素G钾盐，呈粉末状，纯度99.9%，化学式为C16H17KN2O4S，结构式见图1.

图1 PG的结构式

1.2 试验方法

为准确排查PG对种子的生态毒性浓度范围，根据预试验中对4种蔬菜根长抑制率为10%～60%的ρ(PG)，针对不同蔬菜设置了不同ρ(PG)梯度(对于油麦菜和油菜，分别为10、100、200、400、800、1 200、1 600、2 000 和 2 400 mgL；对于生菜和白菜，分别为10、100、200、400、800、1 600、2 400、3 200 和 4 000 mgL).

预处理过程：首先配制体积分数为10%的H2O2溶液，然后对油菜、油麦菜、生菜和白菜4种蔬菜种子消毒10 min，再用蒸馏水反复冲洗并滤干，然后将一张滤纸放于直径90 mm的培养皿中，将配置好的3 mL不同浓度的PG均匀涂在培养皿中，以此作为处理组；对照组(CK)中加入3 mL蒸馏水. 每组处理均设3个重复，用镊子将已选取的大小一致、颗粒饱满的15颗种子均匀点在培养皿中，保持胚根末端与生长方向呈直线，将培养皿置于智能型光照培养箱(GXZ-280，宁波江南仪器厂)中黑暗培养，保持温度(25±1)℃. 每天用称重法加蒸馏水保持恒质量以补充蒸发的水分. 试验第4天后收获幼苗.

1.3 数据测定与分析

培养过程中每天观察种子发芽数，并计算发芽率；收获时用分析天平测量蔬菜幼苗鲜质量；用游标卡尺测量发芽种子的芽长和根长(芽长是指下胚轴基部至芽顶端的长度，根长是指下胚轴基部至主根尖端的长度)，利用IBM SPSS Statistics 22对数据进行单因素(One-way ANOVA)方差分析和差异显著性检验.

发芽率和根长抑制率的计算公式：

GP=nN×100%

(1)

RLI=(RL0-RLt)RL0×100%

(2)

式中：GP为发芽率，%；n为发芽种子数，个；N为供试种子数，个；RLI为根长抑制率，%；RL0为对照组根长，mm；RLt为处理组根长，mm.

利用Origin 2018软件建立幼苗根长抑制率与ρ(PG)的散点图并进行拟合，根据拟合方程计算根长抑制率为50%时对应的青霉素浓度，即为根长半抑制浓度(IC50).

2 结果与讨论

2.1 不同浓度PG处理对4种蔬菜发芽率的影响

发芽率是反映外界环境变化对种子萌发影响的重要指标. 不同浓度PG对油麦菜、油菜、白菜和生菜发芽率的影响如表1所示. 从表1可知，各处理组的4种蔬菜种子发芽率均与对照组无显著性差异(P>0.05)，这与Gomes等[17]研究环丙沙星对玉米种子萌发的影响结果相似. 究其原因：①种皮可阻碍抗生素对蔬菜种子萌发产生的负面影响[18]；②种子萌发是以吸水膨胀为主的物理过程[19-20]，且种子本身具有抗逆性，可通过自身的代谢反应抵抗、削弱甚至修复抗生素的加入对发芽产生的影响[21]. 因此，发芽率不能全面反映青霉素污染的生态毒性效应.

表1 不同浓度PG对4种蔬菜种子发芽率的影响

2.2 不同浓度PG处理对4种蔬菜种子芽长的影响

与发芽率相比，PG对4种蔬菜种子芽长的影响较为明显. 从图2可知，不同浓度PG对油菜和白菜种子的芽长均起到了促进作用，随着ρ(PG)的升高，处理组油菜种子的芽长受促进现象最为明显，当ρ(PG)≥1 200 mgL时，其芽长增长率在60%左右且与对照组相比具有显著差异(P<0.05)；处理组白菜种子的芽长均随ρ(PG)的增加呈现先升高后降低的趋势. 在试验浓度范围内，PG对油麦菜种子的芽长呈现抑制作用，对生菜种子的芽长则呈现出先促进后抑制的现象，ρ(PG)为800 mgL时生菜种子的芽长达到最大值(26.51 mm)，较对照组增加了27.06%；当ρ(PG)>800 mgL，随着ρ(PG)的增加其抑制作用逐渐增强. 魏子艳等[22]研究发现，金霉素浓度在30～90 mgL之间时，随着浓度的升高，其对黄瓜种子芽长的抑制作用不断增强. 这是因为种子胚根先与抗生素溶液接触，吸收抗生素并输送到胚中，当抗生素浓度在其中的积累超出其耐受范围时，芽长则受到显著抑制. 在该试验中，油菜和白菜均属于十字花科芸薹属，PG对其芽长表现为促进作用；油麦菜和生菜均属于菊科莴苣属，处理组中其芽长的变化趋势表现为先升高后降低. 造成不同属蔬菜芽长在青霉素胁迫下变化趋势不同的原因，可能与蔬菜中营养物质的储存状态有关[23]. 与莴苣属蔬菜相比，芸薹属蔬菜种子中不具有淀粉粒，使得抗生素作用在不同属蔬菜中的靶分子不同[24]，但其具体机制还需进一步研究.

注：同种蔬菜不同字母表示差异显著(P<0.05).

2.3 不同浓度PG处理对4种蔬菜种子根长和幼苗鲜质量的影响

胚根是种子萌发后首先出现的器官，具有固着、贮存合成氨基酸和植物激素等有机物质的作用，其主功能是吸收环境中水分及养分，并通过维管组织输送给茎[25]. 由图3可以看出，在试验浓度范围内，与对照组相比，处理组4种蔬菜种子的根长均随ρ(PG)的增加而呈现抑制作用逐渐增强的现象. 这与多位学者的研究结果相似，例如，魏子艳等[22]采用水培法研究磺胺对甲氧嘧啶的浓度对油菜、黄瓜和白菜根长的影响，发现在磺胺对甲氧嘧啶浓度为0～90 mgL时，处理组3种蔬菜根长随其浓度的升高而受到明显抑制作用，与对照组根长差异性显著(P<0.01)；LUO等[26]研究表明，在四环素浓度为5～200 μmolL时，随着浓度的增加，白菜种子根长呈显著下降的趋势，与对照组相比具有极显著差异(P<0.01). 目前，关于抗生素对植物根长抑制的原因主要包括：①植物根与抗生素直接接触而最先受到污染[27-28]；②抗生素溶液改变了植物抗氧化防御系统中超氧化物歧化酶、过氧化物酶等酶的活性，导致可溶性糖减少，从而影响了根的形成[29-30]；③抗生素通过影响DNA和RNA的合成，抑制根部细胞的分裂[31].

根是吸收环境中水分的主要营养器官，而水分是蔬菜鲜质量的主要限制因子，所以根的发育状态直接影响蔬菜幼苗鲜质量. 如图3所示，4种蔬菜幼苗鲜质量随ρ(PG)的变化情况不尽相同. 各处理组中油菜、白菜和生菜的鲜质量均随ρ(PG)的升高呈现先升后降的趋势，当ρ(PG)为200 mgL时，生菜鲜质量为0.29 g，较对照组增加10.37%；当ρ(PG)为400 mgL时，白菜鲜质量达到峰值，较对照组增加5.76%. 油麦菜鲜质量随ρ(PG)的升高则呈现下降趋势. 当ρ(PG)为 2 400 mgL时，油麦菜、油菜、白菜和生菜的鲜质量较对照组分别下降了48.07%、16.56%、27.12%和40.78%，这表明在相同浓度(2 400 mgL)下，PG对油麦菜幼苗鲜质量的影响高于其他3种蔬菜.

注：不同小写字母表示鲜质量差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示根长差异显著(P<0.05).

2.4 4种蔬菜不同毒性指标对PG敏感程度分析

根是蔬菜主要的吸收和代谢器官，同时也是最容易受毒物分子影响的部位，且与PG直接接触，可通过影响蔬菜根部的抗氧化防御系统和细胞分裂来影响根长[30-31]. 有研究指出，种子萌发发生在植物暗生芽期，此时胚根是快速生长的器官，对抗生素敏感[23]，因此4种蔬菜根长在PG存在下均受到抑制. 由图3可知，PG对部分处理组油菜、白菜和生菜的鲜质量呈促进作用，对所有处理组油麦菜均呈抑制作用. 在高浓度(1 200 mgL)下，油麦菜幼苗鲜质量与对照组相比具有显著差异(P<0.05)，而在较低浓度(200 mgL)时，其根长与对照组相比已具有显著差异(P<0.05)，因此4种蔬菜幼苗鲜质量对PG的敏感性小于根长.

抗生素对芽长的作用机制主要是种子胚根先吸收抗生素并沿着胚轴向上输送给芽，所以与芽相比，根中抗生素累积量最多[32]. 已有研究[33-35]指出，随着抗生素浓度的升高，蔬菜芽长和根长逐渐受到抑制，且受抑制程度表现为根长>芽长. 在试验浓度范围内，生菜芽长随ρ(PG)的升高呈现先升高后降低的趋势；与其幼苗鲜质量相比，芽长在较高浓度(800 mgL)时达到最大值. PG对各处理组油菜和白菜芽长均呈促进作用，但对部分处理组油菜和白菜鲜质量呈促进作用. 油麦菜芽长在PG存在下受到抑制，且在较高浓度(2 000 mgL)下与对照组相比具显著差异(P<0.05). 所以与幼苗鲜质量相比，4种蔬菜芽长对PG较不敏感. 将PG与4种蔬菜不同毒性指标进行显著性差异分析，P值均表现为发芽率>芽长>鲜质量>根长(见表2)，所以4种蔬菜的生长指标对PG的生态敏感性均表现为根长>鲜质量>芽长>发芽率，即根长对PG较敏感. CHENG等[36]指出，有机化合物在相同浓度下对幼苗根长的抑制作用大于其他参数，林琳等[29]的研究结果表明，与鲜质量和茎长相比，白菜根长对四环素更敏感，与笔者试验结果相似.

表2 PG与4种蔬菜不同指标的显著性差异分析(P值)

2.5 PG对4种蔬菜根长抑制率的剂量-效应关系

目前，研究者多采用半抑制浓度(IC50)来评估污染物对动植物的生态毒性[37]，IC50越小，表明污染物对研究对象的毒性越强. 如图4所示，为进一步评估PG对4种蔬菜的生态毒性，建立了不同浓度PG对4种蔬菜根长抑制率的响应曲线，并以此推导出ρ(PG)与根长抑制率回归方程用以解析IC50. 通过数据拟合，解析出油麦菜、油菜、白菜和生菜根长抑制率与ρ(PG) 的关系均符合Allometric模型，即y=axb〔其中，x为ρ(PG)，y为根长抑制率，a和b均为常数〕. 如表3所示，油麦菜、油菜、白菜和生菜根长抑制率对ρ(PG)的回归分析的R2分别为0.91、0.98、0.92和0.95，表明试验数据与该模型符合度良好.

表3 PG与4种蔬菜根长抑制率的回归分析

通过剂量-效应曲线计算得到PG对油麦菜、油菜、白菜和生菜4种蔬菜根长的IC50，分别为 1 675.11、995.67、3 736.40 和 2 510.24 mgL. 由此可知，4种蔬菜对PG的敏感程度表现为油菜>油麦菜>生菜>白菜(P<0.05). 这表明在试验浓度范围内，相比于其他3种蔬菜，PG对油菜根长的抑制作用较显著，即油菜更适合作为PG生态毒性指示植物. 研究[22]指出，在同种试验方法下，金霉素、诺氟沙星和磺胺对甲氧嘧啶对油菜根长的IC50分别为31.27、532.95和0.06 mgL，远小于笔者试验中PG对小油菜根长的IC50(995.67 mgL)，主要是因为各类抗生素亲水和疏水性不同及化学或物理性质(如分子量)不同[38]. 较其他种类抗生素而言，PG具强亲水性，且具有β-内酰胺环，化学性质不稳定，这可能是造成蔬菜根长IC50较高的原因.